王千慧 黃竹青 鄭劍玲 劉 穎 卜 桐 付趙軍 谷思文 張 帆 齊 賀

遼寧省基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 遼寧醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院(遼寧 沈陽 110101)

隨著經(jīng)濟(jì)增長,我國酒精飲品消耗量顯著增加,如何消除過度飲酒所帶來的健康隱患和相關(guān)疾病已成為世界性問題。據(jù)統(tǒng)計(jì),酗酒是導(dǎo)致疾病與殘疾的第三大危險(xiǎn)因素之一,目前已證明有200余種疾病與過度飲酒相關(guān)[1]。酒精除了對肝臟、胰腺等造成損傷之外,還對胃腸道粘膜造成直接或間接的損害[2-3]。北蟲草(Cordyceps militaris),又稱為北冬蟲夏草,屬于子囊菌類的麥角菌目,麥角菌科,真菌屬[4]。北蟲草中富含腺苷、蟲草素、蟲草酸、小分子肽等多種活性物質(zhì),具有良好的調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、抗腫瘤、抗感染等藥理學(xué)作用[5-7]。但其水提物對胃組織酒精損傷的保護(hù)作用卻鮮有研究,因此本文通過測定小鼠酒精胃損傷后胃組織中SOD,GST,ADH,ALDH活性變化和MDA含量變化,為拓展開發(fā)北蟲草相關(guān)產(chǎn)品提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 50只體重為18～22g昆明小鼠,雌雄各半分籠飼養(yǎng),購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(遼)2015- 0001。

1.2試劑與儀器設(shè)備 超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測試劑盒、丙二醛(MDA)含量檢測試劑盒、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)活性檢測試劑盒、乙醇脫氫酶(ADH)活性檢測試劑盒、乙醛脫氫酶(ALDH)活性檢測試劑盒均購于北京索萊寶生物科技有限公司。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 北蟲草水提物制備方法 本研究采用低、高溫提取相結(jié)合方法。低溫提取溫度為45℃,物料比1∶30,提取3h,然后采用4000rpm離心10min,分離得到上清液Ⅰ；對沉淀進(jìn)行第二次高溫提取,設(shè)定溫度80℃,物料比1∶30,提取3.5h后采用4000rpm離心10min,得上清液Ⅱ,合并兩次上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)進(jìn)行濃縮,最后將濃縮液凍干得到粉末,置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?。使用時(shí),用純化水進(jìn)行溶解,現(xiàn)用現(xiàn)配[8]。

1.3.2 造模及給藥方法 50只昆明小鼠,雌雄各半,體重:18～22g,隨機(jī)分成五組。空白對照組:常規(guī)飼料,飲食自由,每日上午用蒸餾水(10ml/kg)灌胃,3h后再次采用蒸餾水(0.1ml)灌胃；病理模型組:常規(guī)飼料,飲食自由,參考蔡琦、李楊等人的造模方法和預(yù)實(shí)驗(yàn)情況,本課題組每日上午采用35%酒精(10ml/kg)灌胃,3h后采用蒸餾水(0.1ml)灌胃[9-10]；北蟲草低、中、高濃度給藥組:常規(guī)飼料,飲食自由,每日上午采用35%酒精(10 ml/kg)灌胃,3h后分別采用0.5g/kg、1.0g/kg和2.0g/kg北蟲草水提物進(jìn)行灌胃,飼養(yǎng)14天,末次灌胃后禁食不禁水,24h后處死小鼠并立刻取出小鼠胃組織備用[8]。

1.3.3 指標(biāo)測定 將各組胃組織按0.1g/1ml(組織/提取液)加入相應(yīng)提取液,于冰浴下進(jìn)行勻漿,然后將勻漿液置于超聲波細(xì)胞粉碎儀中,采用功率200w、超聲3s、間隔10s并重復(fù)超聲30次進(jìn)行細(xì)胞破碎。按各試劑盒說明書要求分別離心獲取各組小鼠胃組織上清液,分別測定各組小鼠胃組織上清液中SOD,GST,ADH和ALDH活性及MDA含量。

1.4數(shù)據(jù)處理 本研究數(shù)據(jù)均采用SPSS 13.0進(jìn)行分析,所得數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多樣本間均值差異采用t檢驗(yàn),以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1肉眼觀察對照組、病理模型組和高濃度給藥組小鼠胃組織病理變化 通過肉眼觀察對照組、病理模型組和高濃度給藥組小鼠胃組織可以發(fā)現(xiàn):對照組小鼠胃內(nèi)組織光滑、完整,褶皺正常,未出現(xiàn)充血點(diǎn)等病理情況,病理模型組小鼠則出現(xiàn)明顯的充血點(diǎn),表明酒精對小鼠胃組織造成損傷,而高劑量給藥組小鼠胃組織中充血點(diǎn)明顯減少。

圖1 對照組、病理模型組和高濃度給藥組小鼠胃組織病理改變

2.2不同濃度北蟲草水提物對小鼠胃組織中SOD、MDA的影響 與對照組小鼠相比,病理模型組小鼠胃組織中SOD活性下降(242.61±35.60 vs 171.91±14.81,P<0.05)；與病理模型組相比,給藥組小鼠胃組織中SOD活性明顯增強(qiáng),且存在濃度依賴性(171.91±14.81 vs 274.01±45.32,P<0.05;171.91±14.81 vs 297.99±44.98,P<0.01;171.91±14.81 vs 301.52±48.58,P<0.05)。與對照組小鼠相比,病理模型組小鼠胃組織中MDA含量明顯增高(5.05±0.78 vs 12.01±1.02,P<0.01)；北蟲草低劑量組小鼠其MDA含量與模型組小鼠相比無明顯差異,北蟲草中、高劑量組小鼠其MDA含量均明顯下降,且呈現(xiàn)濃度依賴性(12.01±1.02 vs 7.75±0.46,P<0.01;12.01±1.02 vs 5.13±0.39,P<0.01)。

圖2 各組小鼠胃組織中SOD活性#:與對照組相比,P<0.05;*:與模型組相比,P<0.05;**:與模型組相比,P<0.01

圖3 各組小鼠胃組織中MDA含量#:與對照組相比,P<0.05;##:與對照組相比,P<0.01;**:與模型組相比,P<0.01

2.3不同濃度北蟲草水提物對小鼠胃組織中GST的影響 GST在機(jī)體內(nèi)能夠催化谷胱甘肽與多種有毒物質(zhì)結(jié)合,在人體Ⅱ期解毒過程中發(fā)揮發(fā)揮著重要應(yīng)用[11]。與對照組小鼠相比,病理模型組小鼠胃組織中GST活性明顯下降(3.52±0.68 vs 0.97±0.22,P<0.01)；與病理模型組小鼠相比,北蟲草水提物低、中、高劑量均使小鼠胃組織中GST活性升高(0.97±0.22 vs 1.70±0.27,P<0.05;0.97±0.22 vs 2.02±0.16,P<0.01;0.97±0.22 vs 3.42±0.46,P<0.01),且呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性。

圖4 各組小鼠胃組織中GST活性#:與對照組相比,P<0.05;*:與模型組相比,P<0.05;**:與模型組相比,P<0.01

2.4不同濃度北蟲草水提物對小鼠胃組織中ADH和ALDH的影響 與對照組小鼠相比,病理模型組小鼠胃組織中ADH與ALDH活性均略有升高(0.44±0.03 vs 0.49±0.01,P<0.05;106.67±13.33 vs 167.33±22.37,P<0.05)；與病理模型組小鼠相比,北蟲草中、高劑量組小鼠胃組織中ADH活性明顯增強(qiáng)(0.49±0.01 vs 0.81±0.09,P<0.01;0.49±0.01 vs 0.74±0.11,P<0.01),低劑量組無明顯變化；同時(shí)與病理模型組小鼠相比,給藥組小鼠胃組織中ALDH活性均升高,且存在濃度依賴性(167.33±22.37 vs 196.33±19.77,P<0.05;167.33±22.37 vs 252.67±41.84,P<0.05;167.33±22.37 vs 262.33±37.85,P<0.01)。

圖5 各組小鼠胃組織中ADH活性#:與對照組相比,P<0.05;*:與模型組相比,P<0.05;**:與模型組相比,P<0.01

圖6 各組小鼠胃組織中ALDH活性變化#:與對照組相比,P<0.05;*:與模型組相比,P<0.05;**:與模型組相比,P<0.01

3 討論

SOD是機(jī)體抗氧化系統(tǒng)中最重要的酶類之一。生理?xiàng)l件下,胃腸道本身會(huì)產(chǎn)生并釋放少量氧自由基,上皮細(xì)胞中的NADPH等氧化酶也會(huì)產(chǎn)生氧自由基和H2O2,此時(shí)機(jī)體依靠SOD等重要的抗氧化損傷防御系統(tǒng)及時(shí)清除體內(nèi)的氧自由基,防止其達(dá)到組織損傷水平,而MDA正是這些自由基脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物,且MDA可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸等生物學(xué)大分子發(fā)生交聯(lián),產(chǎn)生細(xì)胞毒性。因此SOD和MDA被公認(rèn)為能較好反映機(jī)體內(nèi)自由基變化和氧化損傷的兩個(gè)重要指標(biāo)。目前大量meta分析表明酒精可以引起胃黏膜損傷、胃潰瘍、胃癌及肝硬化等疾病的發(fā)生[12-14],同時(shí)最新的研究表明活性氧是乙醇引起黏膜損傷的重要因素之一[13,15-16]。因此,氧化應(yīng)激損傷是導(dǎo)致以上疾病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[17]。同時(shí)還有研究發(fā)現(xiàn)乙醇可以抑制機(jī)體抗氧化酶和其他細(xì)胞保護(hù)蛋白的表達(dá),包括超SOD-1和過氧化還原酶,從而加速ROS的生成[18]。本研究發(fā)現(xiàn)給予酒精后小鼠胃組織中SOD活性下降,且MDA含量明顯增高,表明酒精對小鼠胃組織已經(jīng)造成氧化損傷,而北蟲草水提物可以提高小鼠酒精損傷后胃組織中SOD活性,并降低MDA含量,且存在明顯濃度依賴性,表明北蟲草具有良好的抗氧化能力,可以有效降低氧自由基對機(jī)體造成的損傷,起到抗氧化損傷作用。

GST是一類具有多種生理功能的蛋白質(zhì)家族,主要催化各種親電性化合物與GSH巰基發(fā)生共價(jià)結(jié)合,因此GST在許多外源性、內(nèi)源性化合物的解毒和代謝中起著重要作用[19-21]。據(jù)報(bào)道,酒精引起胃組織嚴(yán)重氧化應(yīng)激過程中,除MDA含量增加外還降低胃谷胱甘肽含量來刺激脂質(zhì)過氧化[22-24],因此提高GST活性對乙醇導(dǎo)致的胃損傷保護(hù)作用至關(guān)重要。本研究中發(fā)現(xiàn):與對照組小鼠相比,病理模型組小鼠胃組織中GST活性明顯下降,表明短期、高劑量飲酒可使其清除體內(nèi)有毒物質(zhì)的能力下降,進(jìn)而加重胃損傷；而給予北蟲草提取物后,其GST活性明顯升高,且存在濃度依賴性,表明北蟲草可以通過提高GST活性降低乙醇對胃組織的毒性作用。

乙醇脫氫酶(ADH)是機(jī)體內(nèi)乙醇代謝最為重要的酶類之一,可將乙醇氧化成乙醛,主要分布于肝臟組織中。Pestalozzi等人發(fā)現(xiàn)ADH也存在于胃腸道中,這表明酒精在進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)前先經(jīng)過消化系統(tǒng)代謝,此現(xiàn)象被稱為乙醇的首過代謝(First pass metabolism,FPM)[25],而Jelski W等人研究發(fā)現(xiàn)FPM主要發(fā)生在胃組織中[26]。王國祥等人發(fā)現(xiàn)長時(shí)間攝入乙醇會(huì)導(dǎo)致胃腸道組織中ADH 活性下降,因此提高機(jī)體胃組織中ADH活性可以減少機(jī)體對乙醇的生物利用度,緩解乙醇對肝臟、腦組織等重要組織器官的毒害作用[27]。本研究發(fā)現(xiàn)與對照組小鼠相比,病理模型組小鼠其胃組織中ADH活性略有升高,表明短期、高劑量飲酒可以刺激小鼠胃組織,使其ADH活性增強(qiáng)；同時(shí)在給予北蟲草水提物后,進(jìn)一步增強(qiáng)給藥組小鼠胃組織中ADH活性,表明北蟲草水提物可以增強(qiáng)乙醇的代謝,減輕肝臟代謝負(fù)荷,降低乙醇對肝、腦等重要組織的損傷。

乙醇經(jīng)ADH或其他酶類體系氧化成乙醛,乙醛經(jīng)過乙醛脫氫酶(ALDH)進(jìn)一步氧化后成乙酸鹽,且乙醛已被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)列為人類一類致癌物質(zhì),因此,乙醇代謝相關(guān)酶類的缺乏或功能失活,尤其是ADH和ALDH,可能會(huì)直接影響其致癌作用[28]。國外學(xué)者Nagayoshi等人發(fā)現(xiàn),乙醇可以導(dǎo)致ALDH-2基因敲除小鼠胃組織DNA損傷,表明ALDH缺乏可能加速胃癌發(fā)生[29]。因此胃組織中ALDH活性對乙醛導(dǎo)致的消化道損傷起到至關(guān)重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)給予酒精后小鼠胃組織中ALDH 活性增強(qiáng),且給藥組ALDH活性也有所上升,表明北蟲草可以提高胃組織中ALDH的活性,加速乙醇代謝中間產(chǎn)物乙醛的代謝,降低乙醇對消化道細(xì)胞的毒性損傷作用,減輕胃組織損傷,其作用機(jī)制可能與防止DNA損傷及降低炎癥反應(yīng)有關(guān)[28]。因此,北蟲草提取物可以通過增強(qiáng)胃組織ADH、ALDH 活性,加速乙醇的代謝過程,降低中間代謝產(chǎn)物產(chǎn)生的消化道細(xì)胞毒性作用,降低乙醇對肝的毒性作用及負(fù)荷。

各組小鼠胃組織病理變化情況發(fā)現(xiàn),高濃度給藥組小鼠胃組織損傷情況較模型組小鼠有明顯改善；此外實(shí)驗(yàn)過程中,病理模型組小鼠在飼養(yǎng)至7～10天時(shí),其進(jìn)食、進(jìn)水量明顯低于給藥組和對照組小鼠,進(jìn)一步表明北蟲草水提物對小鼠胃組織具有一定的保護(hù)作用,與上述檢測結(jié)果相吻合。

綜上,北蟲草水提物可以提高小鼠酒精性胃損傷模型其胃組織中SOD、GST、ADH、ALDH活性,同時(shí)降低MDA含量,且存在一定的濃度依賴性,表明北蟲草水提物在降低氧化應(yīng)激損傷、增強(qiáng)乙醇代謝等方面起到關(guān)鍵作用；同時(shí)本研究中采用了宋靜靜等人的研究成果進(jìn)行北蟲草水提物制備,其水提物中含有豐富的蟲草多糖、蟲草酸、腺苷和蟲草素[8],表明這些活性物質(zhì)很有可能參與到上述調(diào)節(jié)機(jī)制中,為北蟲草活性物質(zhì)的研究及酒精性胃損傷的預(yù)防與治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),為開發(fā)北蟲草相關(guān)產(chǎn)品奠定基礎(chǔ)。