謝榮 韓俊杰 寶麗 劉宏偉

(1 西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院蔬菜研究所，西藏 拉薩 850000；2 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，北京 100000）

白肉靈芝Ganoderma leucocontextum是新發(fā)現(xiàn)的靈芝品種之一[1]。西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院蔬菜研究所與中國(guó)科學(xué)院微生物研究所合作開(kāi)展白肉靈芝活性物質(zhì)分析與功效研究。自2014年拉薩國(guó)家農(nóng)業(yè)科技示范園區(qū)馴化栽培白肉靈芝成功后[2-3]，白肉靈芝在拉薩市曲水縣聶當(dāng)鄉(xiāng)、才納鄉(xiāng)，林芝市巴宜區(qū)，工布江達(dá)縣巴河鎮(zhèn)，米林縣、波密縣的脫貧攻堅(jiān)中發(fā)揮了重要作用。高效液相檢測(cè)發(fā)現(xiàn)西藏白肉靈芝中含有26個(gè)新三萜化合物，并確立指紋圖譜，且部分活性萜類(lèi)極具有開(kāi)發(fā)價(jià)值[4-8]。白肉靈芝子實(shí)體原料品質(zhì)的好壞，直接影響到活性物質(zhì)成分等相關(guān)產(chǎn)品的質(zhì)量。因此，有必要對(duì)影響白肉靈芝子實(shí)體中三萜質(zhì)量分?jǐn)?shù)及組分的原因進(jìn)行分析。筆者著重分析連作與不連作、不同栽培料配方對(duì)同一種源白肉靈芝子實(shí)體中三萜質(zhì)量分?jǐn)?shù)和組分的影響，為西藏標(biāo)準(zhǔn)化栽培白肉靈芝及其質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為連作與不連作年份、不同栽培料栽培的白肉靈芝子實(shí)體。

1.2 試驗(yàn)方法

每年4月埋菌棒覆土栽培白肉靈芝，9月前完成白肉靈芝采收并清除廢菌棒，次年栽培白肉靈芝前翻耕土壤，清除雜草、石塊，撒石灰澆透水，晴天日光暴曬數(shù)日殺菌滅蟲(chóng)。

1.2.1 連作與不連作對(duì)白肉靈芝三萜質(zhì)量分?jǐn)?shù)和組分的影響

栽培地在拉薩國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技示范園區(qū)日光溫室，重復(fù)5個(gè)大棚。栽培料配方為棉籽殼45%，木屑45%，麩皮8%，石灰1%，石膏1%。分析2017年、2018年、2019年三年連作和2020年換土栽培(不連作）的白肉靈芝子實(shí)體三萜質(zhì)量分?jǐn)?shù)及組分。

1.2.2 栽培料對(duì)白肉靈芝三萜質(zhì)量分?jǐn)?shù)和組分的影響

試驗(yàn)配方6個(gè)。配方1：棉籽殼45%，木屑45%，麩皮5%，玉米芯3%，石灰1%，石膏1%；配方2：棉籽殼45%，木屑45%，玉米芯8%，石灰1%，石膏1%；配方3：棉籽殼45%，木屑45%，麩皮8%，石灰1%，石膏1%；配方4：棉籽殼40%，木屑40%，麩皮18%，石灰1%，石膏1%；配方5：河南產(chǎn)35 cm原櫟木段；配方6：河南產(chǎn)25 cm原櫟木段。每個(gè)配方3次重復(fù)。

1.3 白肉靈芝三萜質(zhì)量分?jǐn)?shù)及組分的測(cè)定

白肉靈芝子實(shí)體于50℃的烘箱內(nèi)脫水，20 h后取出，粉碎，過(guò)孔徑0.42 mm的篩備用。

1.3.1 總?cè)瀑|(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

1.3.1.1 供試品溶液的制備

精確稱取樣品5.0 g，置于圓底燒瓶?jī)?nèi)，加入100 mL乙醇，回流提取2 h，濾去濾渣，即得供試品溶液。

1.3.1.2 對(duì)照品溶液的制備

取齊墩果酸對(duì)照品20.00 mg，加甲醇定容至100 mL，即得0.20 mg/mL的對(duì)照品溶液。

1.3.1.3 顯色方法

靈芝總?cè)瀑|(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定采用冰醋酸-香草醛法。精確量取供試品溶液或?qū)φ掌啡芤褐糜?5 mL具塞試管中，揮干，放冷，精確加入現(xiàn)配的冰醋酸-香草醛溶液(精確稱取香草醛0.5 g，加冰醋酸使溶解成10 mL，即得。下同）0.2 mL、高氯酸0.8 mL，搖勻，70℃水浴15 min，立即置冰浴5 min，取出，精確加入乙酸乙酯4 mL，搖勻。以相應(yīng)試劑為空白，紫外-可見(jiàn)分光光度法，在波長(zhǎng)546 nm處測(cè)定吸光度。

1.3.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精確量取對(duì)照品溶液0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.8 mL，分別置15 mL具塞試管中，揮干，放冷，精確加入新配制的香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，搖勻，70℃水浴15 min，立即冰浴5 min，取出，精確加入乙酸乙酯4 mL，搖勻。以相應(yīng)試劑為空白，紫外-可見(jiàn)分光光度法，在波長(zhǎng)546 nm處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程為Y=5.4062X-0.0403，相關(guān)系數(shù)R=0.9995，表明方程擬合度較好。

1.3.2 三萜組分測(cè)定

采用高效液相色譜(HPLC）測(cè)定白肉靈芝三萜組分。流速：1 mL/min，色譜柱：YMC，C18，250 mm×4.6 mm，高效液相洗脫流程見(jiàn)表1。

表1 高效液相洗脫流程

2 結(jié)果與分析

2.1 連作對(duì)白肉靈芝三萜質(zhì)量分?jǐn)?shù)及組分的影響

由表2可以看出，栽培地2017年、2018年連作兩年后2019年再栽培白肉靈芝，其總?cè)瀑|(zhì)量分?jǐn)?shù)下降明顯，由最初的17.1 mg/g下降至15.0 mg/g；2020年換土后栽培的白肉靈芝三萜質(zhì)量分?jǐn)?shù)又有所上升，為16.8 mg/g。由圖1得出，供試白肉靈芝三萜組分為混源萜類(lèi)化合物、白肉靈芝特有三萜、傳統(tǒng)赤靈芝三萜、三萜法尼基復(fù)合物類(lèi)。2020年換土后栽培的白肉靈芝各組分三萜的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于2017、2018、2019年。HPLC分析結(jié)果表明連作栽培白肉靈芝影響其三萜組分。因此，2019年的供試白肉靈芝子實(shí)體總?cè)瀑|(zhì)量分?jǐn)?shù)減少與液相圖譜變化均能說(shuō)明連作障礙是主要原因之一。

圖1 不同栽培年份白肉靈芝子實(shí)體三萜組分

表2 不同栽培年份的白肉靈芝總?cè)瀑|(zhì)量分?jǐn)?shù)

2.2 栽培料對(duì)白肉靈芝三萜質(zhì)量分?jǐn)?shù)和組分的影響

由表3可知，配方5、配方6的白肉靈芝總?cè)瀑|(zhì)量分?jǐn)?shù)偏低，配方1、配方2的白肉靈芝中總?cè)瀑|(zhì)量分?jǐn)?shù)較高。由圖2可知，三萜組分中，配方3、配方4的混源萜類(lèi)化合物和白肉靈芝特有三萜較豐富。配方1、配方2的白肉靈芝特有三萜和傳統(tǒng)赤靈芝三萜較豐富，這與配方1、配方2、配方3、配方4總?cè)瀑|(zhì)量分?jǐn)?shù)較配方5、配方6高的結(jié)果一致。

表3 不同配方料栽培的白肉靈芝子實(shí)體三萜質(zhì)量分?jǐn)?shù)

圖2 不同配方栽培白肉靈芝的三萜組分及各組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)

3 小結(jié)

試驗(yàn)結(jié)果表明，連作障礙影響三萜質(zhì)量分?jǐn)?shù)及組分，不同栽培料配方對(duì)三萜質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響也較大。配方5、配方6的供試白肉靈芝子實(shí)體總?cè)瀑|(zhì)量分?jǐn)?shù)低，但這兩個(gè)配方的子實(shí)體三萜組分更豐富，各組分質(zhì)量分?jǐn)?shù)也更高。目前，關(guān)于白肉靈芝活性成分與生物活性的研究較多[9-12]，但還需進(jìn)一步系統(tǒng)比較高效液相分析的白肉靈芝三萜組分變化，這對(duì)提升栽培白肉靈芝的品質(zhì)具有現(xiàn)實(shí)意義。