朱鏈 侯怡鈴 白鑫 楊彤 陳茜 丁祥*

(1 西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 南充 637000；2 西華師范大學(xué)西南野生動(dòng)植物資源保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 南充 637000；3 西華師范大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，四川 南充 637000）

鑒別真菌的傳統(tǒng)方法主要為觀察真菌的形態(tài)和微觀特征，輔以生理、生化和營(yíng)養(yǎng)試驗(yàn)。但是，對(duì)于許多大型真菌來(lái)說(shuō)，如果僅從真菌的形態(tài)、生理和生化特性來(lái)鑒定，不僅要求鑒定者有豐富的真菌鑒定工作經(jīng)驗(yàn)，同時(shí)還要花費(fèi)大量的時(shí)間。尤其對(duì)于某些生長(zhǎng)條件特殊的、形態(tài)相似性高的真菌，如果僅僅通過(guò)傳統(tǒng)的表型特征來(lái)識(shí)別，通常會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果，較難區(qū)分[1]。當(dāng)今核酸分子生物學(xué)技術(shù)已應(yīng)用于各學(xué)科。真菌核酸基因組中有4個(gè)編碼核糖體RNA的基因(rDNA），該序列高度保守，并包含可變區(qū)和高變區(qū)。編碼rRNA的核苷酸序列隨時(shí)間變化非常緩慢，可用于相對(duì)較遠(yuǎn)生物體的進(jìn)化比較。因此對(duì)rDNA的序列分析可用于鑒定未知分子量或驗(yàn)證表型鑒定結(jié)果[2-5]。筆者參照文獻(xiàn)從形態(tài)特征對(duì)來(lái)自四川省宜賓市老君山的6株真菌和四川省甘孜藏族自治州雅江縣的6株真菌進(jìn)行初步鑒定，并用rDNA-ITS序列分析法對(duì)菌株的宏觀鑒定做補(bǔ)充和修正。

1 材料與方法

1.1 真菌樣本采集地概況

雅江縣位于四川省甘孜藏族自治州，地處青藏高原東緣的高山峽谷與草原的過(guò)渡帶，地形復(fù)雜，形成了獨(dú)特而神奇的自然景觀，且豐厚的土壤也為許多真菌提供了理想的生長(zhǎng)環(huán)境。真菌樣本采集地海拔4 218 m，北緯29°41.902′，東經(jīng)101°09.4208′。

老君山位于四川省南部，有較原始的森林植被。該地雨量充沛，光照適宜，土壤有機(jī)質(zhì)豐富，適宜真菌生長(zhǎng)。真菌采集地海拔1 193 m，北緯27°50′，東經(jīng)103°36′。

1.2 試驗(yàn)材料

真菌樣品于2019年8月采集于四川省宜賓市老君山(標(biāo)記為13號(hào)、14號(hào)、15號(hào)、19號(hào)、20號(hào)、24號(hào)）和四川省甘孜藏族自治州雅江縣(標(biāo)記為Y30號(hào)、Y31號(hào)、Y41號(hào)、Y46號(hào)、Y61號(hào)、Y83號(hào)）。采集真菌過(guò)程中記錄其生長(zhǎng)環(huán)境、生長(zhǎng)習(xí)性，拍照，然后將其晾干帶回西華師范大學(xué)西南野生動(dòng)植物資源保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，儲(chǔ)存于-80℃冰箱。

1.3 主要試劑

2×Taq PCR Master Mix(武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司），DNA提取試劑盒、DNA純化回收試劑盒(天根生物科技有限公司），PCR引物(成都生工生物技術(shù)有限公司），乙醇等化學(xué)試劑(成都金山化學(xué)試劑有限公司），ddH2O(實(shí)驗(yàn)室自制）。

1.4 主要儀器

臺(tái)式離心機(jī)Mikro 120(北京博瑞祥騰科技有限公司），PCR儀Thermal Cycler 2720(Applied Biosystem美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司），電泳儀DYY-6 C(北京六一儀器廠），紫外分析儀Gel DocTMXR+(BIORAD伯樂(lè)生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司），ABI 3730 3730 XL(Applied Biosystem美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 傳統(tǒng)分類(lèi)法鑒定

根據(jù)12株真菌菌株形態(tài)學(xué)特征，參照《中國(guó)大型真菌彩色圖譜》[6《]中國(guó)大型菌物資源圖鑒》[7《]中國(guó)真菌志》[8]鑒定其種屬。

1.5.2 真菌總DNA提取

取10 mg樣品菇體，將其剪碎，迅速加入液氮研磨成粉狀，之后轉(zhuǎn)移至2 mL離心管，65℃水浴30～40 min，然后加入800 μL體積比為24∶1的氯仿∶異戊醇溶液，搖勻靜置15 min，12 000 g離心10 min。將上清液轉(zhuǎn)移至滅菌離心管中，加入1 mL 95%冰凍乙 醇，用 手 輕 搖2 min，-20℃冷 凍 至 少0.5 h，12 000 g離心10 min，棄上清液，加入1 mL 70%乙醇，靜置5 min，12 000 g離心10 min，棄上清液。在潔凈工作臺(tái)中干燥沉淀物，再溶于50 μL TE緩沖液中提取總DNA，并放入-20℃冰箱保存以待擴(kuò)增。

1.5.3 真菌基因組ITS序列PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增參考文獻(xiàn)[9]。

1.5.4 PCR結(jié)果檢測(cè)

取擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物7.0 μL并與6×Loading Buffer混勻，在含有10 mg/mL Gold View 3%的瓊脂糖凝膠上點(diǎn)樣，于1.0×TAE緩沖液(電壓為120 V）中電泳。電泳結(jié)束后取出凝膠放在凝膠成像系統(tǒng)中，觀察并拍照。

1.5.5 ITS片段純化以及測(cè)序

根據(jù)PCR電泳的結(jié)果，將500～700 bp的目的條帶用無(wú)菌手術(shù)刀切下，并用凝膠回收試劑盒回收純化，將純化后的PCR產(chǎn)物送北京奧維森基因科技有限公司進(jìn)行上下游引物雙向測(cè)序，得到測(cè)序結(jié)果。

1.6 進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

將測(cè)序結(jié)果利用BankIt工具上傳至GeneBank，獲得登錄號(hào)，選擇其中最短的擴(kuò)增序列，以此長(zhǎng)度為基本比對(duì)長(zhǎng)度，在NCBI(National Center for Biotechnology Information）數(shù)據(jù)庫(kù)尋找登記序列中含有與12種真菌樣品序列相似度高的片段，通過(guò)BLAST工具和DNAMAN軟件對(duì)序列進(jìn)行分析，截去兩側(cè)擴(kuò)增差異較大的堿基對(duì)，使比對(duì)的序列大小幾乎一致，重新用Clustalx軟件進(jìn)行完全比對(duì)，用MEGA7.0軟件采用鄰位相連法(N-J，neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)[10-12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 傳統(tǒng)分類(lèi)法的初步鑒定結(jié)果

采集的12株真菌菌株形態(tài)特征如圖1。根據(jù)其生境形態(tài)特征(菌蓋、菌環(huán)、菌褶、菌柄等）及文獻(xiàn)[6-8]初步鑒定：13號(hào)為黏滑菇Hebeloma；14號(hào)、15號(hào)、19號(hào)和20號(hào)為粉褶菌Entoloma；24號(hào)為球蓋菇Hy?pholoma；Y30號(hào)、Y31號(hào)、Y41號(hào)、Y46號(hào)、Y61號(hào)、Y83號(hào)均為絲膜菌Cortinarius。

圖1 12株真菌生境形態(tài)特征

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

提取12株真菌菌株總DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其rDNA-ITS的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳后均能擴(kuò)增出目的條帶，擴(kuò)增產(chǎn)物分子量均在500～750 bp(圖2）。

圖2 12株真菌菌株的rDNA-ITS PCR擴(kuò)增電泳圖

2.3 DNA-ITS序列測(cè)序與比對(duì)結(jié)果

將12種真菌樣品的擴(kuò)增測(cè)序結(jié)果上傳至Gene-Bank，獲得其登錄號(hào)。13號(hào)樣品登錄號(hào)為PW911200963，14號(hào)樣品登錄號(hào)為PW911130573，15號(hào)樣品登錄號(hào)為PW911130578，19號(hào)樣品登錄號(hào)為PW911151178，20號(hào) 樣 品 登 錄 號(hào) 為PW 911151190，24號(hào)樣品登錄號(hào)為PW911200959，Y30號(hào)樣品登錄號(hào)為NR131871.1，Y31號(hào)樣品登錄號(hào)為NR153055.1，Y41號(hào)樣品登錄號(hào)為NR154868.1，Y46號(hào)樣品登錄號(hào)為NR153055.1，Y61號(hào)樣品登錄號(hào)為NR131871.1，Y83號(hào)樣品登錄號(hào)為NR154868.1。將樣品序列與從GeneBank獲取的相似較高序列經(jīng)DNA-MAN和Clustalx軟件比對(duì)分析，并用MEGA7構(gòu)建N-J系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖3）。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)并結(jié)合各比對(duì)指標(biāo)來(lái)確定距離與相似性均具有較大鑒定意義的比對(duì)序列[13-15]。13號(hào)(PW911200963）與Hebeloma limbatum(Bull.）Quél.的相似性達(dá)99%；14號(hào)(PW911130573）、15號(hào)(PW911130578）與奧米粉褶菌Entoloma omienseE.HoraK.相似性達(dá)99%；19號(hào)(PW911200963）與灰粉褶菌Entoloma ameidesFr.相似性達(dá)99%；20號(hào)(PW911151178）與白方孢粉褶菌Entoloma murrayialbusLiu相 似 性 達(dá)99%；24號(hào)(PW911200959）與簇生黃韌傘Hypholoma fascicu?lareQuél.相似性達(dá)99%；Y30號(hào)(NR131871.1）與布里絲膜菌Cortinarius bulliardii相似性達(dá)99%；Y31號(hào)(NR153055.1）與Cortinarius ferrugineifolius相似性達(dá)99%；Y41號(hào)(NR154868.1）與Cortinarius decipiens相似性達(dá)99%；Y46號(hào)(NR153055.1）與Cortinarius hinnuleocervinus有較高的相似性；Y61號(hào)(NR131871.1）與布里絲膜菌Cortinarius bulliardii有較高相似性；Y83號(hào)(NR154868.1）與Cortinarius de?cipiens相似性達(dá)99%。

圖3 12株真菌菌株的rDNA-ITS序列的N-J系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

3 小結(jié)與討論

采用傳統(tǒng)分類(lèi)與分子生物學(xué)相結(jié)合的方法鑒定采自四川省宜賓老君山6株真菌菌株，四川省甘孜藏族自治州雅江縣6株真菌菌株，結(jié)果表明，傳統(tǒng)分類(lèi)法與rDNA-ITS序列分析法鑒定結(jié)果一致。

傳統(tǒng)分類(lèi)結(jié)合現(xiàn)代分子技術(shù)是鑒定真菌種類(lèi)非常重要的方法。在應(yīng)用傳統(tǒng)分類(lèi)法鑒定時(shí)需要鑒定者準(zhǔn)確分析真菌的形態(tài)特征并依據(jù)真菌鑒定圖譜找到可能的真菌種類(lèi)，因此傳統(tǒng)分類(lèi)法要求鑒定者有豐富經(jīng)驗(yàn)，鑒定真菌難度較高。分子序列相似性分析比較盡管更有參考作用，但不同物種之間的ITS序列差異越來(lái)越小，因此僅依靠分子生物學(xué)方法也不能準(zhǔn)確鑒定出真菌的種類(lèi)，所以分子序列分析與傳統(tǒng)的分類(lèi)方法相結(jié)合才能更準(zhǔn)確鑒定種屬，也更客觀。