李迪諾，李諶

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胃外科；2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院分子檢測(cè)中心，遼寧 錦州 121000)

胃癌是全球第二大常見(jiàn)的惡性腫瘤[1]。原癌基因的激活、抑癌基因的缺失等在胃癌的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色[2]。

CHD1L(chromodomain helicase/adenosine triphosphatase DNA binding protein 1-Like，CHD1L)位于人類(lèi)1號(hào)染色體的長(zhǎng)臂的1q21區(qū)，由53152個(gè)堿基對(duì)組成，包含23個(gè)外顯子、一個(gè)編碼長(zhǎng)度為897個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)開(kāi)放閱讀結(jié)構(gòu)和一個(gè)保守區(qū)域[3-4]。

CHD1L過(guò)表達(dá)會(huì)導(dǎo)致染色質(zhì)過(guò)度松弛，使DNA堿基發(fā)生錯(cuò)配現(xiàn)象，導(dǎo)致癌癥的演變[5-6]，過(guò)度表達(dá)CHD1L顯著促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，沉默CHD1L基因可降低前列腺癌細(xì)胞的侵襲遷移能力[7]，下調(diào)CHD1L mRNA表達(dá)水平肝癌細(xì)胞增殖能力、遷移和侵襲能力明顯下降[8]；靶向CHD1L通過(guò)PI3K/Akt/MMP信號(hào)通路可以抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲[9]；但能否促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移未有相關(guān)研究，本文通過(guò)研究胃癌生物學(xué)行為過(guò)程中CHD1L信號(hào)通路調(diào)控機(jī)制，探究其潛在價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人胃粘膜上皮細(xì)胞株GES-1和胃癌細(xì)胞株SGC-7901、MKN-45、MGC-823、MGC-803來(lái)源于國(guó)家中心細(xì)胞庫(kù)，胃癌MGC-823細(xì)胞株中的CHD1L表達(dá)含量較高，可以用于后續(xù)試驗(yàn)。

慢病毒pLVshRNA-Puro構(gòu)建由美國(guó)Clon-tech公司完成、Western Blot測(cè)定相關(guān)試劑與耗材、細(xì)胞增殖活性、凋亡檢測(cè)相關(guān)試劑與耗材購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司、細(xì)胞侵襲試驗(yàn)所需試劑與耗材由Millipore公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 慢病毒shRNA序列構(gòu)建

GENEBANK數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)CHD1L mRNA全序列進(jìn)行搜索，利用在線(xiàn)設(shè)計(jì)軟件(http：//www.exiqon.com/)，設(shè)計(jì)特異性shRNA序列(CHD1L-shRNA-1、CHD1L-shRNA-2、CHD1L-shRNA-3)。將pLVshRNA-Puro片段(NotⅠ和EcoRⅠ雙酶切處理)與5’端磷酸化，互補(bǔ)片段退火處理后的合成片段連接，命名為pLVshRNA-Puro-CHD1L，陰性對(duì)照組命名為pLVshRNA-Puro-NC，利用大腸桿菌K-12的衍生菌DH5α制備陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序鑒定后將陰性對(duì)照質(zhì)粒和干擾質(zhì)粒進(jìn)行包裝后保存于-80 ℃冰箱內(nèi)。

1.2.2 慢病毒感染MGC-823細(xì)胞

將MGC-823細(xì)胞接種于6孔板中(2×105個(gè)/孔)，分別取3組0.5 mL濃縮病毒和陰性對(duì)照感染MGC-823細(xì)胞48 h后，將嘌呤霉素加到繼續(xù)培養(yǎng)24 h后的細(xì)胞中，使其最終濃度為0.25 μg/mL，48 h后會(huì)形成細(xì)胞克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)單克隆細(xì)胞集落。

1.2.3 沉默CHD1L干擾序列的篩選

MGC-823細(xì)胞被慢病毒感染后提取其總蛋白，Western Blot計(jì)算CHD1L蛋白和β-actin蛋白積分光密度(integrated optical density，IOD)，篩選出沉默率最大的干擾組序列。

1.2.4 Western Blot測(cè)定胃癌細(xì)胞相關(guān)蛋白的表達(dá)

利用沉默率最大的慢病毒感染MGC-823細(xì)胞后，Western Blot測(cè)定與胃癌細(xì)胞p53、p21、Nur77、ARHGEF9的表達(dá)。

1.2.5 CHD1L沉默對(duì)胃癌細(xì)胞增殖與凋亡的影響

1.2.5.1 MTT測(cè)定CHD1L沉默對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響

96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中接種200 μL稀釋好的MGC-823細(xì)胞(1×103個(gè)/孔)，利用MTT細(xì)胞活力測(cè)定法，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖抑制率進(jìn)行測(cè)定與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

抑制率(%)=(1-干擾組OD/對(duì)照組OD)×100%

1.2.5.2 流式細(xì)胞測(cè)定CHD1L沉默對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的影響

MGC-823被慢病毒感染48 h后，經(jīng)胰酶消化、PBS重懸漂洗、離心，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)，24 h后胰酶消化成單細(xì)胞懸液，利用Attune NxT流式細(xì)胞儀測(cè)定CHD1L沉默對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的影響。

1.2.6 CHD1L沉默對(duì)胃癌上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

將MGC-823細(xì)胞各分為兩部分(5×105個(gè)/毫升)。Transwell小室侵襲在培養(yǎng)48 h后對(duì)遷移的細(xì)胞數(shù)、細(xì)胞劃痕愈合測(cè)定方法對(duì)細(xì)胞間距離的均值進(jìn)行測(cè)定和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，探討其對(duì)胃癌上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響。

抑制率=(對(duì)照組-干擾組)/對(duì)照組×100%

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 慢病毒感染胃癌細(xì)胞介導(dǎo)CHD1L基因沉默細(xì)胞株的建立

慢病毒感染MGC-823細(xì)胞48 h后，熒光蛋白表達(dá)率約為50%，隨著傳代次數(shù)的增加(3代、15代、25代)，熒光蛋白表達(dá)率能穩(wěn)定的保持在95%左右，說(shuō)明慢病毒可穩(wěn)定與靶細(xì)胞的基因組進(jìn)行整合，見(jiàn)圖1。

A：CHD1L-shRNA-1組；B：CHD1L-shRNA-2組；C：CHD1L-shRNA-3組；D：陰性對(duì)照組

2.2 胃癌細(xì)胞CHD1L蛋白的表達(dá)情況

與陰性對(duì)照組相比，CHD1L-shRNA-1、CHD1L-shRNA-2、CHD1L-shRNA-3干擾下胃癌細(xì)胞CHD1L蛋白表達(dá)量均下降，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.013、P=0.035、P=0.027)，CHD1L-shRNA-1基因沉默效果最好，可進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)，見(jiàn)圖2～3。

A：NC對(duì)照組β-actin與CHD1L蛋白表達(dá)；B：CHD1L-shRNA-3組β-actin與CHD1L蛋白表達(dá)；C：CHD1L-shRNA-2組β-actin與CHD1L蛋白表達(dá)；D：CHD1L-shRNA-1組β-actin與CHD1L蛋白表達(dá)

圖3 Western Blot免疫印跡檢測(cè)CHDIL蛋白表達(dá)

2.3 CHD1L沉默對(duì)胃癌細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

CHD1L-shRNA-1干擾下的胃癌細(xì)胞p53蛋白質(zhì)表達(dá)量比對(duì)照上調(diào)31.24%，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.041)；Nur77蛋白質(zhì)表達(dá)量比對(duì)照上調(diào)52.36%，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.026)；p21表達(dá)水平提高了48.37%(P=0.030)；ARHGEF9蛋白質(zhì)表達(dá)量比對(duì)照上調(diào)49.78%，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.019)，CHD1L沉默對(duì)與腫瘤發(fā)生發(fā)展有抑制作用的效應(yīng)分子產(chǎn)生促進(jìn)作用，見(jiàn)圖4。

A：陰性對(duì)照組不同蛋白表達(dá)情況；B：空白對(duì)照組不同蛋白表達(dá)情況；C：CHD1L-shRNA-1組不同蛋白表達(dá)情況

2.4 MTT測(cè)定CHD1L沉默對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響

與對(duì)照組相比，MGC-823細(xì)胞的增殖過(guò)程被抑制，作用時(shí)間的不斷延長(zhǎng)，MGC-823細(xì)胞的抑制率也不斷增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

圖5 CHD1L沉默時(shí)間對(duì)胃癌細(xì)胞細(xì)胞活力變化的影響

2.5 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定CHD1L沉默對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡與周期分布的影響

CHD1L-shRNA-1與對(duì)照組細(xì)胞相比凋亡趨勢(shì)明顯(P=0.025)，說(shuō)明CHD1L沉默可以誘導(dǎo)MGC-823細(xì)胞凋亡；與對(duì)照組相比，MGC-823細(xì)胞中CHD1L被沉默后S、G1期細(xì)胞數(shù)量分別呈現(xiàn)明顯的減少、增多趨勢(shì)，細(xì)胞周期明顯被阻滯在G1期，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.028、P=0.016)，見(jiàn)圖6～9。

A：CHD1L-shRNA-1實(shí)驗(yàn)組胃癌細(xì)胞凋亡情況；B：陰性對(duì)照組胃癌細(xì)胞的凋亡情況；C：空白對(duì)照組胃癌細(xì)胞的凋亡情況

圖7 CHD1L沉默后胃癌細(xì)胞凋亡率

A：CHD1L-shRNA-1實(shí)驗(yàn)組胃癌細(xì)胞分布周期；B：陰性對(duì)照組胃癌細(xì)胞分布周期；C：空白對(duì)照組胃癌細(xì)胞分布周期

圖9 CHD1L沉默后胃癌細(xì)胞周期分布

2.6 CHD1L沉默對(duì)胃癌上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

2.6.1 CHD1L沉默對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲的影響

CHD1L沉默48 h后，實(shí)驗(yàn)組比陰性對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)量明顯減少(P=0.042)，抑制率為59.55%，說(shuō)明沉默CHD1L能顯著抑制MGC-823細(xì)胞的侵襲力，見(jiàn)圖10 和表1。

A：CHD1L-shRNA-1實(shí)驗(yàn)組胃癌細(xì)胞侵襲情況；B：陰性對(duì)照組胃癌細(xì)胞侵襲情況；C：空白對(duì)照組胃癌細(xì)胞侵襲情況

表1 CHD1L沉默后穿膜胃癌MGC-823細(xì)胞數(shù)量比對(duì)

2.6.2 CHD1L沉默對(duì)胃癌細(xì)胞遷移的影響

CHD1L沉默24 h后，陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組細(xì)胞劃痕已基本長(zhǎng)滿(mǎn)，而實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞之間還存在一定距離的間隙；與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組MGC-823細(xì)胞遷移距離縮短為(0.54±0.34)μm，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.029)，說(shuō)明CHD1L沉默后MGC-823細(xì)胞水平運(yùn)動(dòng)距離明顯降低，有效抑制胃癌細(xì)胞的遷移，見(jiàn)圖11。

A：CHD1L-shRNA-1實(shí)驗(yàn)組胃癌細(xì)胞遷移情況；B：陰性對(duì)照組胃癌細(xì)胞遷移情況；C：空白對(duì)照組胃癌細(xì)胞遷移情況

表2 CHD1L沉默后后胃癌MGC-823細(xì)胞遷移距離

3 討 論

CHD1L屬于SNF-2類(lèi)家族成員中發(fā)揮致癌作用的唯一基因[10]。鼻咽癌和乳腺癌患者中，CHD1L過(guò)表達(dá)可能會(huì)成為重要的預(yù)后標(biāo)志物[11]；在肺腺癌患者中，腫瘤轉(zhuǎn)移與過(guò)表達(dá)CHD1L密切相關(guān)[12]。在肝癌患者中，發(fā)現(xiàn)CHD1L的擴(kuò)增和過(guò)表達(dá)[13]。沉默CHD1L后MGC-823細(xì)胞增殖過(guò)程被抑制，推測(cè)沉默CHD1L后，一些抑癌基因表達(dá)水平顯著提高實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞DNA合成的抑制，說(shuō)明CHD1L可能為臨床基因治療提供新的靶點(diǎn)。

在細(xì)胞外的調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡等信號(hào)刺激下，誘導(dǎo)孤兒受體超家族Nur77與CHD1L結(jié)合后，能使其具有抗細(xì)胞凋亡的能力[14-16]，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CHD1L沉默可以誘導(dǎo)胃癌MGC-823細(xì)胞凋亡，推測(cè)CHD1L沉默后其轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生變化，阻礙了Nur77從細(xì)胞核到線(xiàn)粒體的移動(dòng)[17]。

生長(zhǎng)腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程發(fā)揮至關(guān)重要的作用[18]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：在遷移距離和穿膜細(xì)胞數(shù)量方面實(shí)驗(yàn)組明顯減少，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；ARHGEF9在信號(hào)通路和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)方面起關(guān)鍵作用[19]，ARHGEF9是通過(guò)免疫共沉淀CHD1L相關(guān)的基因克隆所得，推測(cè)CHD1L沉默可以上調(diào)ARHGEF9和Cdc42-GTP表達(dá)水平，抑制了再生化的肌動(dòng)蛋白形成偽足樣結(jié)構(gòu)的步驟，對(duì)胃癌細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和侵襲過(guò)程進(jìn)行抑制。