王匯鋒，陳潔，趙咫龍

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院普外科，遼寧 錦州 121000；2廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肝膽外科，廣西 南寧 530000)

原發(fā)性肝癌(以下簡(jiǎn)稱肝癌)是惡性腫瘤中發(fā)病率高居前列。2020年有研究統(tǒng)計(jì)，在全球多個(gè)國(guó)家和地區(qū)，東亞地區(qū)肝癌發(fā)病率和死亡率占2018年新發(fā)及死亡患者的一半以上，而中國(guó)的5年發(fā)病率位于日本和美國(guó)后居第三[1]。另有統(tǒng)計(jì)，在185個(gè)國(guó)家常見癌癥的統(tǒng)計(jì)中，肝癌的發(fā)病率居第6位，死亡率居第4位[2]。迄今為止，針對(duì)肝癌的診斷和預(yù)后評(píng)估臨床上仍主要依靠影像學(xué)及AFP等腫瘤標(biāo)志物，因此開發(fā)新的標(biāo)志物逐漸成為肝癌研究的熱點(diǎn)之一。因此，對(duì)肝癌分子機(jī)制的研究十分重要，可以從機(jī)制方向打開對(duì)肝癌新的認(rèn)識(shí)，并尋求新的發(fā)現(xiàn)。而且，機(jī)制研究將為揭示肝癌的發(fā)生發(fā)展提供依據(jù)，并為其診斷、臨床治療及預(yù)后評(píng)價(jià)提供理論依據(jù)及選擇支持。

MicroRNA是一類長(zhǎng)度為22～28個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，它們可參與轉(zhuǎn)錄后基因的表達(dá)調(diào)控。研究證實(shí)miRNA對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)、遷移、分化等功能變化存在一定的影響[3]。因此，對(duì)于miRNA的研究有助于揭示腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，為判斷預(yù)后和臨床治療提供依據(jù)。針對(duì)miRNA和肝癌，一直有相關(guān)研究報(bào)道，miRNA的異常表達(dá)影響肝癌的發(fā)生發(fā)展[4-5]，并且已有文獻(xiàn)顯示miR-4282與其他腫瘤相關(guān)[6-8]，但其與肝癌的關(guān)系尚不清楚。因此，本研究主要就miR-4282與肝癌細(xì)胞之間的關(guān)系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721(上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫)在完全培養(yǎng)基[DMEM(Gibco)、胎牛血清(Gibco)和青霉素/鏈霉素]，37 ℃，5% CO2中培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染:準(zhǔn)備miR mimics和inhibitor(銳博)分別按說明書配置后加入含120 μL Opti-MEM(Gibco)的離心管中混勻，其中mimics取50 nM，inhibitor取100 nM。靜置5 min，加入5 μL LipofectamineTM6000(Lipo6000TMTransfection Reagent; Beyotime)混勻，靜置20 min后將混合液均勻輕柔加入孔板中，再加300 μL Opti-MEM，培養(yǎng)6 h后補(bǔ)足培養(yǎng)基，48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR：(1)采用Trizol(Invitrogen)法按說明書操作提取各組細(xì)胞的總RNA；(2)miRNA逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR分別按照miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit(TIANGEN)和miRcute Plus miRNA qPCR Detection Kit(TIANGEN)說明書操作完成；(3)mRNA逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)(TAKARA)和FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)(Roche)說明書操作完成；(4)所有qRT-PCR應(yīng)用STEPONE PLUS(ABI)完成，采用2-△△CT法處理結(jié)果。

GRB2：Forward:5’-CTTAGCAAACAGCGGCACGA-3’；Reverse:5’-TACTTCCCGGCTCCATCTCG-3’

β-actin：Forward:5’-CACCTTCTACAATGAGCTGCGTGTG-3’；Reverse:5’-ATAGCACAGCCTGGATAGCAACGTAC-3’

1.2.3 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)：上室內(nèi)加入200 μL DMEM重懸的4×104個(gè)細(xì)胞，下室加入600 μL完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后擦去上室細(xì)胞，甲醇固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色1 h后拍照計(jì)數(shù)。

1.2.4 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)前12 h將Matrigel∶DMEM=1∶8的混合液滴入上室后置于培養(yǎng)箱內(nèi)。實(shí)驗(yàn)前棄上室液體，用200 μL DMEM重懸5×104個(gè)細(xì)胞并加入上室，下室加入600 μL完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后擦去上室細(xì)胞，甲醇固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色1 h后拍照計(jì)數(shù)。

1.2.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)：準(zhǔn)備新孔板并在背面用記號(hào)筆劃一道直線，接種細(xì)胞后過夜，孔板中細(xì)胞飽和度達(dá)80%以上視為接種滿意，隨后用無菌槍頭在細(xì)胞生長(zhǎng)區(qū)垂直記號(hào)筆劃一直線，加入無血清培養(yǎng)基，48 h后添加5%含血清培養(yǎng)基。分別在0、24、48、72、96 h時(shí)間點(diǎn)以孔板背面直線和劃痕相交處拍照，以保證每次拍照于同一視野處。細(xì)胞遷移率(MR)，MR(%)=[(L0-SLtime point)/L0]×100%。

1.2.6 3’-UTR熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定：將人GRB2 mRNA 3’-UTR序列克隆到pMIRGLO中制備GRB2 3’-UTR載體，PCR合成GRB2 3’-UTR突變結(jié)合位點(diǎn)。根據(jù) LipofectamineTM2000 Transfection Reagent(Life Technologies)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，質(zhì)粒每孔轉(zhuǎn)染 100 ng，miRNA 每孔轉(zhuǎn)染100 nM，轉(zhuǎn)染后48 h按照Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega)說明書進(jìn)行雙熒光素酶檢測(cè)，結(jié)果取海腎熒光值與螢火蟲熒光值比值。

1.2.7 蛋白提取和Western Blot：收集實(shí)驗(yàn)細(xì)胞置于冰上，用RIPA(Biotopped)∶PMSF(Solarbio)=100∶1新制裂解液裂解15 min后，12 000 rpm 4 ℃離心15 min，取上清液即為蛋白并用BCA試劑盒(CWBIO)測(cè)蛋白濃度。取各組蛋白應(yīng)用10% SDS-PAGE分離膠及5% SDS-PAGE濃縮膠進(jìn)行電泳直至分離膠末端，100 V恒壓轉(zhuǎn)膜90 min，5%脫脂奶粉封閉120 min，一抗4 ℃孵育過夜，二抗孵育2 h，ECL試劑盒顯色，拍照。GAPDH一抗(Cell Signaling Technology)，Ras一抗(Abcam)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法及生物信息學(xué)

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)染效率驗(yàn)證

qRT-PCR驗(yàn)證miR-4282 mimics和inhibitor的轉(zhuǎn)染情況，mimics表達(dá)量(28.326±2.301)高于NC(1.052±0.0854)，t=16.196，P=0.004。inhibitor表達(dá)量(0.287±0.037)低于NC(1.075±0.193)，t=27.320，P=0.001，見圖1。

A B C

2.2 miR-4282表達(dá)量變化后遷移能力的變化

通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表1所示，上調(diào)組愈合率增長(zhǎng)減慢，下調(diào)組愈合率增長(zhǎng)迅速，見圖1C、圖2。miR-4282上調(diào)后遷移細(xì)胞多于對(duì)照組[(8±3)vs(30±4),F=46.784，P=0.000]，miR-4282下調(diào)后低于對(duì)照組[(45±5)vs(31±9),F=11.824，P=0.000]，空白組(30±8)，見圖3。

圖2 細(xì)胞劃痕對(duì)比圖(照片)

圖3 Transwell遷移實(shí)驗(yàn)對(duì)比圖及統(tǒng)計(jì)

表1 miR-4282表達(dá)量變化后愈合率變化

2.3 miR-4282表達(dá)量變化后侵襲能力變化

相較于對(duì)照組，miR-4282上調(diào)后穿透小室的細(xì)胞數(shù)目減少[(12±7)vs(24±2)，F(xiàn)=2.602，P=0.000]，而miR-4282下調(diào)后穿透到小室外的細(xì)胞數(shù)明顯增多[(34±8)vs(20±3)，F(xiàn)=14.553，P=0.000]，空白組：(22±6)，見圖4。

圖4 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果及統(tǒng)計(jì)

2.4 miR-4282互作基因預(yù)測(cè)

為了尋找與miR-4282相互作用的基因，我們通過TargetScan等多個(gè)生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫分析對(duì)比對(duì)、做韋恩圖、TCGA數(shù)據(jù)庫中癌癥下調(diào)基因相同比對(duì)等方法分析篩選后，結(jié)果顯示，miR-4282可能與VEGFR、PI3K、GRB2等基因相互作用，通過查詢KEGG PATHWAY網(wǎng)站中的通路圖功能相適應(yīng)，我們選擇了GRB2這個(gè)基因作為驗(yàn)證與miR-4282的互作基因。

為了探究GRB2可以與哪些基因或蛋白相互作用，我們通過文獻(xiàn)查找和應(yīng)用STRING網(wǎng)站及KEGG PATHWAY網(wǎng)站進(jìn)行綜合分析，結(jié)果顯示GRB2可通過激活ERBB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響細(xì)胞的侵襲、遷移功能，并影響Ras蛋白的表達(dá)。根據(jù)目前生物信息學(xué)分析結(jié)果，我們確定下一步以GRB2基因?yàn)檠芯糠较颍骄縨iR-4282如何影響肝癌細(xì)胞系SMMC-7721的生物學(xué)功能。

2.5 miR-4282表達(dá)量變化對(duì)GRB2 基因的影響

通過雙熒光素酶檢測(cè)證明GRB2-WT+NC和GRB2-WT+MiR-4282組表達(dá)量有差異(P<0.05)，miR-4282可影響GRB2基因表達(dá)，見圖5A。通過qRT-PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)miR-4282上調(diào)時(shí)GRB2基因表達(dá)量下調(diào)[(0.499±0.150)vs(1.397±0.632),t=4.719,P=0.009],miR-4282下調(diào)時(shí)GRB2基因表達(dá)量上調(diào)[(1.726±0.198)vs(0.965±0.129),t=5.179,P=0.035]，見圖5B。

2.6 miR-4282轉(zhuǎn)染后Ras蛋白表達(dá)量的變化

通過對(duì)ERBB通路的進(jìn)一步了解及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的分析，我們?cè)谕分羞x擇了關(guān)鍵的Ras蛋白來驗(yàn)證，探究上調(diào)及下調(diào)miR-4282是否對(duì)Ras蛋白的表達(dá)量產(chǎn)生影響。結(jié)果顯示，miR-4282上調(diào)后Ras蛋白表達(dá)量下降[(0.639±0.075)vs(1.164±0.193)，t=3.583，P=0.023]；反之蛋白表達(dá)量升高[(1.503±0.187)vs(0.994±0.918)，t=3.45，P=0.026]，見圖5C、5D。

A：雙熒光素酶報(bào)告；B：miR-4282表達(dá)量變化后GRB2基因的變化；C、D：Western Blot實(shí)驗(yàn)顯示miR-4282表達(dá)量變化后Ras蛋白的變化

3 討 論

全世界每年肝癌新發(fā)例數(shù)超過100萬。而且肝癌患者普遍存在發(fā)現(xiàn)晚、預(yù)后差，生存期短等特點(diǎn)。因此，尋找一種高特異性及敏感度的生物標(biāo)志物是肝癌基礎(chǔ)研究的一個(gè)方向。miRNA是非編碼RNA中的一種，目前許多研究都發(fā)現(xiàn)miRNA在癌細(xì)胞中異常表達(dá)，并影響癌細(xì)胞功能的變化[9-10]，這也促使miRNA的研究變成腫瘤研究的熱點(diǎn)。

目前已有文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)現(xiàn)，miR-4282與結(jié)腸癌、乳腺癌、口腔鱗癌相關(guān)，其在3種腫瘤細(xì)胞系中均存在低表達(dá)，且miR-4282低表達(dá)可促進(jìn)3種腫瘤細(xì)胞的增殖，并且促進(jìn)乳腺癌和結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲[6-8]197-205，8763-8771，8035-8047。這說明miR-4282在這3種結(jié)腸、乳腺及口腔細(xì)胞中起抑癌基因作用，腫瘤使miR-4282在細(xì)胞中的表達(dá)量降低，并促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)，并且可加速乳腺癌及結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移。根據(jù)以上文獻(xiàn)可以推測(cè)，miR-4282的低表達(dá)預(yù)示著結(jié)腸癌及乳腺癌預(yù)后不良。相關(guān)文獻(xiàn)的研究結(jié)果與我們的相似，通過前期實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)，和正常肝細(xì)胞相比，miR-4282在肝癌細(xì)胞中也處于低表達(dá)狀態(tài)[11]。

根據(jù)體外功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們得知上調(diào)miR-4282可降低SMMC-7721細(xì)胞的侵襲、遷移能力，下調(diào)可促進(jìn)侵襲、遷移能力。綜合前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們推斷miR-4282與其他文獻(xiàn)對(duì)其報(bào)道的相同，在肝細(xì)胞中同樣作為抑癌基因表達(dá)并發(fā)揮作用。根據(jù)生物信息學(xué)分析并驗(yàn)證后，我們發(fā)現(xiàn)miR-4282可以影響生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白2(growth factor receptor-bound protein 2，GRB2)的表達(dá)。GRB2能夠同時(shí)與Shc、Sos結(jié)合形成Shc-GRB2-Sos復(fù)合物，并將Sos激活，激活的Sos與質(zhì)膜上的Ras蛋白結(jié)合，并將其激活,引起信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)。目前已有研究顯示，miR-98-5p可通過GRB2抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲[12]；Qizhong Shi等研究顯示MiR-433-3p過表達(dá)通過抑制GRB2基因表達(dá)來抑制食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲[13]；Xinjing Wang等研究發(fā)現(xiàn)，miR-329通過GRB2/pERK影響胰腺癌細(xì)胞的增殖和凋亡能力[14]。以上文獻(xiàn)說明GRB2基因作為腫瘤增殖、侵襲等功能變化的一個(gè)重要基因與多種腫瘤相關(guān)miRNA的表達(dá)相關(guān)，這些miRNA的異常表達(dá)后通過影響GRB2基因表達(dá)從而影響腫瘤的功能變化。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)顯示，miR-4282也可影響Ras蛋白的表達(dá)。通過通路圖及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，我們發(fā)現(xiàn)GRB2位于ERBB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，并且GRB2能夠激活Ras蛋白。GRB2基因通過Ras蛋白是一種小G蛋白，Zhou B等發(fā)現(xiàn)，突變激活狀態(tài)的Ras蛋白是近30%的人類癌癥的關(guān)鍵致癌驅(qū)動(dòng)因子，而且Ras蛋白與突變體Ras具有同種型時(shí)，野生型Ras蛋白可能充當(dāng)腫瘤抑制因子，但當(dāng)Ras蛋白與突變體Ras具有不同種型時(shí)，野生型Ras蛋白起著促進(jìn)腫瘤作用[15]。有研究證實(shí)，miR-411-5p下調(diào)后通過miR-411-5p-GRB2-Ras途徑促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖，遷移和侵襲[16]；Wei-Jiang等發(fā)現(xiàn)，miR-1258可通過GRB2/Ras/ERK途徑抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖[17]。我們發(fā)現(xiàn)，GRB2-Ras是多種腫瘤發(fā)展的一個(gè)重要途徑。且調(diào)控GRB2表達(dá)的上游miRNA和受其調(diào)控的下游蛋白均有很多種，但該途徑的主要作用是調(diào)控腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲能力，GRB2和Ras均位于ERBB通路中，該通路是調(diào)控腫瘤侵襲遷移的重要通路。因此我們可以推斷，激活后異常表達(dá)的GRB2可能導(dǎo)致多種腫瘤發(fā)生侵襲遷移能力的變化，而miR-4282-GRB2-Ras途徑作為影響肝癌侵襲遷移的發(fā)現(xiàn)可為臨床治療提供一個(gè)新的靶點(diǎn)，即通過阻斷miR-4282的表達(dá)影響肝癌細(xì)胞的侵襲、遷移，而檢測(cè)miR-4282也可成為判斷肝癌預(yù)后的一個(gè)新的分子標(biāo)志物。

綜上所述，本研究認(rèn)為miR-4282通過miR-4282-GRB2-Ras途徑影響肝癌細(xì)胞的侵襲、遷移能力。希望能為臨床上提供了一個(gè)新的分子標(biāo)志物，為肝癌的診斷、預(yù)后判斷提供新的參考依據(jù)。