韓志富

(聯(lián)勤保障部隊(duì)第九四一醫(yī)院，西寧 810000)

女性易發(fā)原發(fā)性肺小動(dòng)脈高壓 (pulmonary hypertension，PH)，具有明顯的性別差異性。已有很多研究發(fā)現(xiàn)雌激素對(duì)肺動(dòng)脈具有保護(hù)作用[1，2]，但在低氧性肺動(dòng)脈高壓(Hypoxic pulmonary hypertension，HPH)的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中，β-E2是否具有保護(hù)作用尚未定論。本研究擬明確β-E2對(duì)大鼠HPH的相關(guān)作用及可能作用機(jī)制。

1.材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

成年雄性SD大鼠(體重：150±20g)購(gòu)自蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SYXK(甘)2018-0003。

1.1.2 儀器及試劑

JY92-II超聲波細(xì)胞粉碎儀購(gòu)自寧波新芝生物儀器公司；RPMI 1640培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Hy-Clone公司；Eppendorf-5430型臺(tái)式超高速低溫離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；萊卡RM224-5型石蠟切片機(jī)購(gòu)自德國(guó)萊卡生物儀器公司；Motic SMZ140解剖顯微鏡購(gòu)自香港MOTIC公司；ZTE-202型恒溫干燥箱購(gòu)自上海器特儀器有限責(zé)任公司；M-MuLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自英國(guó)Invitrogen公司；瓊脂糖及嗅化乙錠(EB)購(gòu)自美國(guó)Amresco公司；β-E2購(gòu)自美國(guó)SA公司；DNA Ladder Marker 2000購(gòu)自西安舟鼎生物試劑有限責(zé)任公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)POWERWAVE公司；GeneAmp 9700型RT-PCR儀購(gòu)自美國(guó)Life Technologies公司；Biosens SC810型凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自上海Biosens公司；PowerPac Basic電泳儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司?？勾笫驪27kip 1抗體購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；抗大鼠Skp-2抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；抗大鼠AKT-P抗體購(gòu)自美國(guó)Ce1lSignaling公司；抗大鼠p-actin抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；HRP標(biāo)記的山羊-抗鼠二抗及商品化免疫組化試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物試劑有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組

1.2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

將約200 g的成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為常氧組和低氧組。常氧組大鼠置常氧動(dòng)物室中(大氣壓強(qiáng)約580mmHg，PO2為120mmHg，O2濃度約為18%)中飼養(yǎng)；低氧組大鼠置低壓低氧艙(大氣壓強(qiáng)約為380mmHg，PO2為79.6mmHg，O2濃度約為10%)中飼養(yǎng)。

1.2.1.2 細(xì)胞培養(yǎng)分組

實(shí)驗(yàn)分常氧組(Normoxia)、低氧組(Hypoxia)、β-E2干預(yù)組(10-5、10-7、10-9mol/L)。

1.2.2 大鼠PASMCs原代培養(yǎng)與鑒定

取各組大鼠原代肺小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞行細(xì)胞貼壁法培養(yǎng)。一周后在顯微鏡下可見(jiàn)肺小動(dòng)脈組織周?chē)谐仕笮蔚姆蝿?dòng)脈平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)(圖1 A )，且融合生長(zhǎng)的原代PASMCs在對(duì)數(shù)期的細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，且細(xì)胞形態(tài)較整齊、透光性良好，細(xì)胞群在對(duì)數(shù)期內(nèi)都呈現(xiàn)渦旋狀分布 (圖1B )。通過(guò)a-SM-actin免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)多數(shù)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞熒光染色為深紅色，表達(dá)為陽(yáng)性(+)，說(shuō)明本次培養(yǎng)的細(xì)胞就是肺小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，而且陽(yáng)性率高達(dá)95%以上(圖1a )。

(A)PASMCs grew from lung arterial explants；(B)Confluence PASMCs(×100)(a)Fluorescence staining of a-SMA in rat PASMCs(×400)；(b)Hoechst Staining of cell PASMCs；(c)Mix picture of(a)/(b)

1.2.3 平滑肌細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肺小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞用胰蛋白酶消化混勻后，按4×104個(gè)/孔的濃度接種在96孔板中，運(yùn)用血清饑餓法誘導(dǎo)細(xì)胞同步分裂，即先行饑餓培養(yǎng)48 h，再加入1640培養(yǎng)液(含有5%血清)和不同濃度的β-E2培養(yǎng)，在常氧條件和低氧條件下進(jìn)行細(xì)胞原代培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h后分別加入MTT(5mg/mL)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，再加入DMSO(每孔150μL)震蕩10 min，在490 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度值。

1.2.4 檢測(cè)

1.2.4.1 Western Blot實(shí)驗(yàn)

在1.2.3的實(shí)驗(yàn)中，收集細(xì)胞后提取總蛋白，用Western Blot檢測(cè)Skp-2、P27kip1的蛋白表達(dá)水平。

1.2.4.2 RT-PCR實(shí)驗(yàn)

在1.2.3的實(shí)驗(yàn)中，收集細(xì)胞提取RNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)P27kip1、Skp-2的mRNA表達(dá)水平。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 21.0軟件，分析各組數(shù)據(jù)間的差異性選用方差分析法，多組間的差異比較采用LSD法，視P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.結(jié)果

2.1 β-E2對(duì)低氧環(huán)境所誘導(dǎo)肺小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的影響

圖2顯示，較常氧組，低氧組肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞數(shù)增加了約1.5倍，說(shuō)明低氧可以明顯刺激肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖。β-E2干預(yù)組的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖量顯著低于低氧組，β-E2濃度為10-5mol/L時(shí)，較低氧組細(xì)胞增殖數(shù)量減少了43%，說(shuō)明β-E2的干預(yù)有效減少了低氧肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖量。

*：P<0.01，vs normoxia group.#：P<0.01，vs hypoxia group.Values are expressed as

2.2 β-E2對(duì)肺小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞Skp-2、P27kip1表達(dá)的影響

圖3a顯示，較常氧組，經(jīng)低氧刺激的細(xì)胞的P27kip 1表達(dá)水平顯著降低，Skp-2表達(dá)水平顯著升高；相比低氧組，經(jīng)β-E2干預(yù)后的細(xì)胞P27kip 1、Skp-2表達(dá)水平呈下降趨勢(shì)。

圖3b 顯示，常氧組和低氧組P27kip 1轉(zhuǎn)錄mRNA的表達(dá)差異并不顯著、Skp-2表達(dá)差異顯著，說(shuō)明低氧刺激對(duì)P27kip 1的表達(dá)水平未產(chǎn)生明顯影響。即β-E2干預(yù)對(duì)P27kip 1轉(zhuǎn)錄的mRNA的量無(wú)顯著影響，對(duì)Skp-2的表達(dá)存在影響。

2.3 β-E2對(duì)肺小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中的磷酸化AKT水平的影響

(a)Representative Western blotting analysis of P27kip1 and Skp-2 protein levels in rat lungs(b)Representative RT-PCR analysis of P27kip1 and Skp-2 mRNA levels in rat.*：P<0.05，vs hypoxia group.#：P<0.05，vs normoxia group

圖4顯示，低氧組肺小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中的磷酸化AKT的表達(dá)水平明顯高于常氧組，而經(jīng)β-E2干預(yù)后，有效降低了低氧刺激后的磷酸化AKT水平。

Representative Western blotting analysis of AKT-P protein levels in cultured rat PASMCs.*：P<0.01，vs hypoxia group.#：P<0.05，vs normoxia group.Values are expressed as mean±SD(n=3)

3.討論

在HPH的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)肺小動(dòng)脈小血管的重構(gòu)，且肺小動(dòng)脈血管的重構(gòu)機(jī)制非常復(fù)雜，目前尚未完全闡明。已有研究發(fā)現(xiàn)在治療血管性疾病時(shí)，可以把控制細(xì)胞周期作為一個(gè)重要的方法[3]。近年來(lái)P27kip1引起了很多學(xué)者的關(guān)注，作為影響細(xì)胞周期抑制因子和表達(dá)抑癌蛋白，其具有抑制癌細(xì)胞增殖和刺激血管增生的作用[4]。Diez等研究發(fā)現(xiàn)P27kip 1具有抑制動(dòng)脈粥樣硬化和血管平滑肌細(xì)胞增殖的作用[5]。由于Skp-2既是P27kip 1的降解酶，同時(shí)也是一種致癌基因蛋白，因而備受關(guān)注[6-8]。目前已經(jīng)將Skp-2作為癌癥及心血管疾病的治療靶點(diǎn)[9-10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)低氧刺激后，血管平滑肌細(xì)胞P27kip 1、Skp-2和磷酸化AKT的表達(dá)增多，而采取β-E2干預(yù)后，P27kip 1、Skp-2和磷酸化AKT水平都較低氧組有了明顯改善，出現(xiàn)了表達(dá)逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象。因此，通過(guò)調(diào)節(jié)Skp2、P27kip1、AKT信號(hào)通路抑制肺動(dòng)脈肌細(xì)胞的增殖是β-E2發(fā)揮保護(hù)作用的一個(gè)可能機(jī)制。