任 明，保積英，許博林，杜 娟，何 媛，Aqib Bilal

(1.青海大學附屬醫(yī)院心血管內科，西寧 810001；2.青海省人民醫(yī)院心血管內科，西寧 810007；3.青海大學醫(yī)學院，西寧 810001；4.青海大學，西寧 810016)

病態(tài)竇房結綜合征(Sick Sinus Syndrome， SSS)病因及機制目前尚不完全明確，可能與竇房結細胞受損、竇房結內各種離子通道改變、竇房結組織重構等因素有關[1，2]。目前較多文獻認為原發(fā)性心電異常發(fā)病機制主要是由其編碼的離子通道的基因突變引起的，被稱為“離子通道病”[3]。有研究指出，部分SSS的發(fā)生機制也與基因突變有關[1，4，5]。趙允梓等人認為蛋白激酶A錨定蛋白(A-kinase anchoring proteins，AKAPs)家族中的AKAP10基因與心臟傳導系統關系密切[6]，并且指出AKAP10中兩個單核苷酸多態(tài)性位點(rs203462和rs4925060)與竇性停搏密切相關。SSS的基因多態(tài)性研究為該病的診治提供了新思路，有研究認為AKAP10通過調節(jié)心肌細胞對膽堿能迷走神經的敏感性來調節(jié)心率[7]。目前國內對SSS患者基因多態(tài)性的研究僅限漢族人群。青海地區(qū)世居藏族的迷走神經張力略高，致成人心率偏慢[8]，為了解青海地區(qū)漢藏族SSS的發(fā)病與AKAP10基因多態(tài)性的關系及藏族人發(fā)生SSS與漢族之間有無差異性，本研究選取青海地區(qū)漢族、藏族SSS患者及健康對照人群進行對照研究?，F將有關研究情況報告如下。

1.對象與方法

1.1 研究對象

收集青海地區(qū)2018年1月至2019年12月來青海大學附屬醫(yī)院和青海省心腦血管病專科醫(yī)院就診的符合入選標準的人員為研究對象：漢族SSS患者60例，平均年齡62.28±9.58歲，男性31例，女性29例；藏族SSS患者35例，平均年齡64.94±7.24歲，男性20例，女性15例。并將同期來兩院體檢的漢、藏族健康者納入對照組，其中藏族47例，平均年齡58.70±14.49歲，男性18例，女性29例；漢族48例，平均年齡59.67±12.33歲，男性21例，女性27例，各組間年齡、性別比較均無差異(P>0.05)，具有可比性。所有患者或家屬簽署了知情同意書。本研究經青海大學附屬醫(yī)院倫理委員會審核通過。

1.2 研究方法

1.2.1 診斷標準選擇

入選標準參照《內科學》(第九版)標準：所有研究對象心電圖須符合以下條件之一：1)非藥物引起的持續(xù)而顯著的竇性心動過緩(50次/分)，發(fā)作無明顯誘因，和臨床癥狀相關；2)竇性停搏或竇性靜止與竇房阻滯；3)竇房傳導阻滯與房室傳導阻滯并存；4)心動過緩-心動過速綜合征交替發(fā)作；5)既往診斷SSS患者并行起搏器植入治療。

排除標準：伴有影響心臟傳導功能的器質性心臟病(如風濕性心臟病、急性下壁心肌梗死病和先天性心臟病等)患者。

1.2.2 一般資料收集

記錄入選研究對象的年齡、性別、身高、體重，同時采集清晨空腹狀態(tài)下4 mL外周靜脈血，檢測總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、尿素氮(BUN)等生化指標；根據體表心電圖及24小時心電監(jiān)護記錄判斷是否合并心房顫動及左束支傳導阻滯。

1.2.3 實驗步驟設計

取抗凝外周靜脈血2 mL→提取基因組DNA→用PCR擴增目的基因→做PCR產物純化→制備電泳樣品→做序列測定、分析。

1.2.4 實驗過程設定

1.2.4.1 SNaPshot PCR引物設計與擴增、純化

SNaPshot PCR引物見表1。

表1 SNaPshot PCR引物

擴增：使用金牌綠酶 Mix進行擴增，加入金牌綠酶Mix 45 μL、上游Primer(10P)2 μL、下游 Primer(10P)2 μL、gDNA 1 μL。

PCR反應條件：98 ℃預變性120 S；98 ℃變性10 S；60 ℃退火20 S；72 ℃延伸10 S，共35個循環(huán)；72 ℃延伸60 S后置4 ℃環(huán)境保存。

純化：在15 μL PCR產物中加入5USAP和2UExoI，震蕩混勻，置37 ℃環(huán)境保溫1 h，然后置75 ℃保溫15 min以滅活SAP、ExoI酶。

1.2.4.2 SNaPshot 延伸反應

取經過處理的PCR混合液各3 μL，加入5 μL SNapshot Reaction Mix、1 μL混合引物、1 μL DDH2O混合。

單核苷酸延伸：96 ℃變性10 S，50 ℃退火5 S；60 ℃延伸30 S，共25個循環(huán)。置4 ℃環(huán)境保存。

電泳樣品制備：加入上述SNaPshot 0.5 μL、高度去離子甲酰胺9.25 μL、GS-120 LIZ 0.25 μL，95 ℃變性5 min，迅速冰冷4 min。

1.2.4.3 序列測定、分析

光譜校正：將Hi-Di甲酰胺350 μL、Matrix標準品50 μL混合，95 ℃變性5 min→迅速冰冷5 min，平分2管，每管200 μL。分裝至上機板后對3730XL DNA Analyzer進行光譜校正。

毛細管電泳檢測及數據分析：使用3730XL DNA Analyzer儀對制備好的樣品進行毛細管電泳并搜集信號。環(huán)境溫度：18 ℃～25 ℃，毛細管長度：50 cm，加熱爐溫度：60 ℃，運行電壓：15 KV。使用GeneMapper V4.0軟件分析實驗數據，結果使用Sanger軟件測序校正。

1.2.5 統計學處理

2.結果

2.1 各組一般臨床資料比較情況

比較各組研究對象一般臨床資料的差異，分析結果顯示：部分組間合并房顫差異有統計學意義；BMI、TC、LDL及BUN水平在各組間均無統計學差異(P>0.05)，其中，兩兩比較分析結果顯示：1)漢族SSS組與漢族對照組：合并房顫的組間差異具有統計學意義(P<0.05)；2)藏族SSS組與藏族對照組：合并房顫的組間差異具有統計學意義(P<0.05)；3)漢族對照組與藏族對照組間均無統計學意義(P>0.05)。見表2～3。

表2 各組一般資料

表3 各組一般資料(%)

2.2 各組基因型Hardy-Weinberg檢驗結果

對各組rs203462基因型行遺傳平衡的Hardy-Weinberg檢驗，分析結果顯示：藏族SSS組：χ2=1.033，P>0.05；藏族健康對照組：χ2=2.343，P>0.05；漢族SSS組：χ2=1.285，P>0.05；漢族健康對照組：χ2=0.486，P>0.05，藏、漢族SSS組、正常組的研究對象均符合Hardy-Weinberg平衡定律，表明入選人群符合遺傳平衡，具有代表性。

各組rs4925060基因型行遺傳平衡的Hardy-Weinberg檢驗，分析結果顯示：藏族SSS組：χ2=0.990，P>0.05；藏族健康對照組：χ2=0.535，P>0.05；漢族SSS組：χ2=0.413，P>0.05；漢族健康對照組：χ2=0.326，P>0.05，藏、漢族SSS組、正常組的研究對象均符合Hardy-Weinberg平衡定律，表明入選人群符合遺傳平衡定律，具有代表性。

2.3 漢、藏族不同位點SSS組與正常組間比較各基因型及等位基因頻率

分別比較漢、藏族SSS組與對照組在兩個位點rs203462和rs4925060的CC、CT、TT基因型及C、T等位基因頻率，CC、CG、GG各基因型及C、G等位基因頻率的差異用χ2檢驗，分析結果顯示，rs203462位點：1)漢族SSS組與藏族SSS組基因型及等位基因的頻率的差異無統計學意義(P>0.05)；2)藏族SSS組與藏族對照組基因型及等位基因的頻率的差異有統計學意義(P<0.05)；3)漢族SSS組與漢族對照組基因型及等位基因頻率的差異無統計學意義。rs4925060位點：1)漢族SSS組與藏族SSS組基因型及等位基因的頻率的差異均無統計學意義；2)藏族SSS組與藏族對照組基因型及等位基因的頻率的差異均無統計學意義；3)漢族SSS組與漢族對照組基因型及等位基因頻率的差異亦無統計學意義。見表4～5。

表4 漢族和藏族SSS rs203462基因型和等位基因(%)

表5 漢族和藏族SSS rs4925060基因型和等位基因(%)

3.討論

心律失常是當今各個國家死亡的主要原因之一，每年有40萬到46萬美國人死于心律失常引起的猝死[7]。對于SSS的發(fā)病率報道不一，從22%～45%不等[9]。目前關于SSS遺傳學方面的發(fā)病機制已成為研究熱點，國內外學者在動物及人體研究中發(fā)現遺傳基因的突變是導致SSS的主要因素之一[10-15]，如Klotho基因G395A位點多態(tài)性與SSS發(fā)病相關。AKAPs屬于與蛋白質激酶A(PKA)結合的支架蛋白家族，在交感系統興奮的情況下，活化的 PKA可以磷酸化一系列參與調節(jié)電活動性和收縮性的蛋白質，AKAPs是其中一員，參與調節(jié) cAMP/PKA的活性和細胞內的Ca2+信號，進一步調節(jié)心臟的功能。趙允梓等人[6]證實AKAP10中兩個單核苷酸多態(tài)性位點rs203462和rs4925060與竇性停搏相關。我們的研究結果提示，AKAP10中rs203462位點在藏族SSS組及對照組中具有顯著差異，T等位基因的頻率明顯高于藏族健康對照組，攜帶T等位基因可能會增加SSS的易感性。Kammerer等人發(fā)現，1936A→G AKAP10轉換(rs203462)，即第646位氨基酸由異亮氨酸(Ile)變?yōu)槔i氨酸(Val)，進而改變AKAP10與 PKA 調節(jié)亞單位 RI alpha (PKA-RIα) 的結合，進而對心臟離子通道或交換器的磷酸化狀態(tài)產生顯著影響，導致心臟功能障礙[16]。有研究認為，1936A→G，這種轉變與心率變異性和長QT間期有關，同時與心律失常、血壓變化也有關[9，17，18]。研究者發(fā)現AKAP10的I646V(A to G)多態(tài)性與老年人群心電圖中PR間期的變化有關，并且報道了老年人群中的純合子纈氨酸變異體的PR間期明顯低于異亮氨酸純合子個體的PR間期。在AKAP10突變的老鼠模型中，用ECG記錄發(fā)現竇性心動過緩(P-P間期延長)和房室傳導減慢(P-R間期延長)兩種緩慢型的心律失常[19]，并證實了這種突變與膽堿能迷走神經敏感性增高有關。以上研究結果均說明rs203462變異與SSS的發(fā)生有顯著關系，與我們的研究結果一致。藏族人群本身迷走神經活性高致心率偏慢，再加上研究證實AKAP10突變體具有更強的壓力感受反射性，所以藏族SSS的發(fā)生可能與這兩者有關。

我們的研究結果顯示，AKAP10基因rs4925060位點的多態(tài)性與漢、藏族SSS的發(fā)病無關。另外我們的研究結果顯示，AKAP10單核苷酸多態(tài)性rs203462和rs4925060位點基因型與等位基因頻率在漢族SSS與藏族SSS間無差異，Tingley等人在研究中發(fā)現AKAP10突變體I646V在改變心率的研究中發(fā)現這種改變不存在種族、性別、年齡等差異[8]，這與我們的研究結果一致。

本研究比較漢、藏族SSS組與健康對照組一般臨床資料的差異，比較結果顯示：合并房顫(Af)可能與SSS的患病相關。SSS組較健康對照組更易合并房顫的發(fā)生，有研究發(fā)現在快速起搏構建的Af模型中竇房結功能及竇房傳導功能出現明顯障礙，此外Af還會導致心房及竇房結纖維化最終導致SSS的發(fā)生與發(fā)展[20]。劉賽哲等人明確指出，Af是SSS的主要危險因素[21]。由此可見心房顫動既是SSS的重要危險因素，同時也是常見并發(fā)癥。本研究僅僅統計了SSS合并房顫的情況，兩者之間的因果關系有待進一步研究。

綜上所述，青海地區(qū)漢、藏族間AKAP10單核苷酸多態(tài)性位點rs203462及rs4925060基因多態(tài)性無差異性，但AKAP10基因rs203462T/C多態(tài)性可能與藏族人群的SSS發(fā)生有關，攜帶T等位基因可能會增加藏族人群SSS罹患風險，但與漢族無關。本研究結果為青海地區(qū)提高SSS患者的診治水平提供了新的思路。