張 寒，陳 輝，劉麗軍，張致英，楊雪林，渠敬鋒，馬福才，馬利鋒，康龍麗*

(1.西藏民族大學醫(yī)學部高原相關疾病分子遺傳機制與干預研究省級重點實驗室，陜西 咸陽 712082；2.西藏民族大學醫(yī)學部環(huán)境與疾病相關基因研究高校重點實驗室，陜西 咸陽 712082；3.西藏自治區(qū)第二人民醫(yī)院，西藏 拉薩 850000)

高原人群長期處于高原低壓低氧環(huán)境，會發(fā)生特有的慢性高原病(Chronic mountain sickness，CMS)——高原紅細胞增多癥(high altitude polycythemia，HAPC)[1]調(diào)研發(fā)現(xiàn)，同一海拔地區(qū)西藏世居人群HAPC發(fā)病率顯著低于移居漢族人群，且女性患病率(1.9%)低于男性(3.4%)[2]。西藏世居人群可能存在高海拔低氧環(huán)境的適應基因，以抵抗HAPC的發(fā)生。目前，已有多篇文獻認為高原人群HAPC的發(fā)病與基因位點的變異有關，包括PPP1R2P1、SENP1、ANP32D、PIK3CD、EPAS1等[3，4，5]。結合現(xiàn)有文獻報道和課題組前期小樣本測序研究結果[6]，篩選出西藏世居人群發(fā)生HAPC可能的候選基因STAT3、STAT5A、RUNDC3B。本研究采取目標區(qū)域靶向測序技術，探討STAT3、STAT5A、RUNDC3B候選基因多態(tài)性與西藏世居人群HAPC易感性的相關關系，為HAPC的遺傳機制研究提供依據(jù)。

1.對象與方法

1.1 研究對象

根據(jù)“青海標準”[1]，選擇同一時段在西藏民族大學附屬醫(yī)院及西藏自治區(qū)第二人民醫(yī)院就診的西藏世居者，并根據(jù)性別進行分組研究。納入及排除標準：①男性Hb≥21 g/dL，女性Hb≥19 g/dL；②長期居住在3 650米以上的高原地區(qū)；③排除真性和假性以及其他繼發(fā)性紅細胞增多癥。

兩所醫(yī)院共招募927名長期居住于3 650米以上無血緣關系的志愿者，其中HAPC患者567例(男性455例，女性112例)，納入病例組；同期匹配健康對照者360例(男性248例，女性112例)，納入對照組。研究內(nèi)容符合《赫爾辛基宣言》規(guī)定并經(jīng)西藏民族大學醫(yī)學部倫理委員會批準。

1.2 DNA提取方法

采集3 mL外周血液樣本，置于含有乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraaceticacid，EDTA)抗凝的真空采血管中。使用血液基因組DNA提取試劑盒(Tiangen Biotech Co.，Ltd，Beijing，China)按照標準程序分離提取血液基因組DNA樣品。DNA純度和質量通過Nanodrop One分光光度計(Thermo Fisher Scientific Inc.，USA，A260/A280為1.7～2.0)和1.5%瓊脂糖凝膠電泳方法確認：電泳條帶清晰可見，無明顯降解，且無RNA污染。合格樣本置-20 ℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 基因分型方法

根據(jù)目標STAT3、STAT5A、RUNDC3B基因設計高質量的測序引物，以DNA樣品基因組為模板，進行多重PCR擴增。反應采用11個循環(huán)數(shù)的PCR程序，盡可能降低PCR的傾向性。使用Illumina Hiseq(Illumina，CA，USA)平臺，以2×150 bp的雙端測序模式進行高通量測序，獲得基因測序數(shù)據(jù)。在567例HAPC組和360例對照組中，目的區(qū)域95%以上被覆蓋，STAT3、STAT5A、RUNDC3B基因的顯著相關基因型變異被分型。

1.4 統(tǒng)計學方法

使用SPSS v 26.0軟件處理數(shù)據(jù)。為降低關聯(lián)分析中的假陽性概率，以最小等位基因頻率(minor allele frequency，MAF)≥0.05為篩選標準，采用哈-溫平衡(Hardy-Weinberg equilibrium，HWE)法進行SNP質量控制。SNP位點的關聯(lián)分析采用Pearson卡方檢驗/Fisher精確檢驗，并在遺傳模型中使用Plink v 2.0軟件進行非條件logistic回歸分析。多態(tài)性位點之間在遺傳過程中可能出現(xiàn)連鎖不平衡關系，使用 Haploview v 4.2軟件[7](https：//sourceforge.net/projects/haploview/)進行連鎖不平衡(linkage disequilibrium，LD)分析，以此獲得存在較強關聯(lián)性的單倍型域。使用GTEx數(shù)據(jù)庫(https：//www.gtexportal.org/home)對顯著差異位點進行分析。統(tǒng)計學意義定義為P<0.05。

2.結果

2.1 HWE檢驗與MAF分布

所有樣本最終共檢測到11個SNPs位點，SNP位點在對照組中均符合HWE檢驗(均HWE-P>0.05)。以單個位點為單位，比較各SNP位點的基本信息，見表1。

表1 候選基因SNPs位點基本信息

2.2 遺傳模型下SNPs位點與HAPC的關系分析

盡管候選基因SNPs位點在等位基因頻率上沒有統(tǒng)計學差異，但在遺傳模型上分析了篩選出STAT3基因rs2293152位點基因型頻率和HAPC發(fā)病風險的相關性，發(fā)現(xiàn)在隱性模型下，STAT3基因rs2293152位點可能與HAPC患病風險降低有關，攜帶基因型“G/G”個體的患病風險是攜帶基因型“C/C-C/G”的0.67倍(OR=0.67，95%CI=0.46-0.97，P=0.035)，但該位點經(jīng)過FDR校正或Bonferroni校正后，差異無統(tǒng)計學差異(PFDR=0.842，PBonferroni=1.000)，見表2。其余SNP位點在遺傳模型中沒有顯示出與HAPC風險相關的顯著性差異。

表2 STAT3基因rs2293152位點與HAPC風險相關性分析

2.3 連鎖不平衡分析與單倍型構建

連鎖不平衡分析表明，RUNDC3B、STAT3、STAT5A基因SNPs位點均分別構成了1個單倍型域，表現(xiàn)出顯著的連鎖不平衡，見圖1。然而，HAPC組和對照組之間每個單倍型域的單倍型頻率間沒有顯著性差異。

(A)STAT3基因；(B)STAT5A基因；(C)RUNDC3B基因

2.4 性別分層分析

按照受試對象的性別進行分層，HAPC病例組中男性455例、女性112例；同期匹配的健康對照組中男性248例、女性112例。進行遺傳模型分析、連鎖不平衡分析以及單倍型構建，探究候選基因STAT3、STAT5A、RUNDC3B在性別分層后對HAPC的不同影響。結果顯示，各候選基因SNP位點在性別分層后無具有統(tǒng)計學意義的顯著性差異。

2.5 GTEx數(shù)據(jù)庫分析

通過GTEx數(shù)據(jù)庫分析，觀察到STAT3基因rs2293152位點“GG”基因型在健康人的心臟左心室(P=5.86e-3)及垂體(P=3e-2)中的表達存在差異，見圖2。

圖2 STAT3基因rs2293152位點在GTEx數(shù)據(jù)庫的表達圖譜

3.討論

現(xiàn)代生物化學技術的發(fā)展使很多復雜疾病的遺傳機制得到進一步闡明。HAPC是一種在高海拔地區(qū)特發(fā)的慢性高原疾病，與高原低氧低壓環(huán)境密切相關，但同一高海拔地區(qū)人群的發(fā)病率卻存在差異，說明遺傳因素可能發(fā)揮一定作用。本研究對STAT3、STAT5A和RUNDC3B基因采用目標區(qū)域靶向測序，并對測序結果做進一步統(tǒng)計學分析，發(fā)現(xiàn)STAT3基因rs2293152位點的“GG”基因型在隱性模型下能降低HAPC的患病風險，而STAT5A和RUNDC3B基因的多態(tài)性與HAPC患病風險可能無關。

造血過程中，各種細胞因子和生長因子在細胞周期檢查點中起著至關重要的作用。信號轉導和轉錄激活因子(STAT)蛋白是一個由7個成員(STAT1～4，STAT5A/B和STAT6)組成的細胞質轉錄因子家族。每一個家族成員在信號轉導方面都具有獨特的功能，在調(diào)節(jié)細胞對不同類型細胞因子的反應方面扮演著重要角色[8]。人類STAT3基因位于染色體17q21.2區(qū)域，發(fā)生功能獲得性突變時會使患者表現(xiàn)為紅細胞生成障礙，引起血影蛋白缺乏癥，最終可能導致重度難治性溶血性貧血[9]。攜帶STAT3基因突變在同時患有純紅細胞再生障礙性貧血和T細胞大顆粒淋巴細胞性白血病的病人中很常見。靶向敲除STAT3基因的小鼠血液表型與過早衰老和骨髓增生性腫瘤(如紅系異常增生、貧血等)疾病的表型相似[10]。非磷酸化的STAT3具有促進肺癌細胞異染色質形成、體外抑制細胞增殖以及抑制小鼠異種移植物中腫瘤生長的功能[11]。造血系統(tǒng)中STAT3具有內(nèi)在的抗炎活性，能保護造血干細胞和祖細胞對抗炎癥和不適當?shù)幕虮磉_反應，對維持血液細胞譜系平衡至關重要[12]。缺氧條件下，細胞通過STAT3信號通路促進間充質干細胞成骨分化和骨質缺損愈合，下調(diào)STAT3通路可抑制人骨肉瘤細胞的生長并誘導其凋亡[13]。此外，許多研究者認為鐵的失調(diào)與多種疾病有關，鐵可以通過激活CDK1/JAK1/STAT3信號通路引起腫瘤細胞過度增殖。巨噬細胞分泌因子通過STAT3信號誘導肝細胞內(nèi)鐵調(diào)素的表達增加[14]。

內(nèi)脂素能影響血脂代謝調(diào)節(jié)，與缺氧、炎癥及血管增生等多種病理因素有著緊密聯(lián)系。Kaliora A等[15]研究發(fā)現(xiàn)，攜帶STAT3 rs2293152 G等位基因能導致內(nèi)脂素(visfatin)水平顯著增加，對脂肪性肝病患者產(chǎn)生有益影響。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)STAT3基因rs2293152位點的“GG”基因型在隱性模型下能降低HAPC的患病風險。我們推測HAPC患者內(nèi)脂素水平可能也發(fā)生了一定變化，從而在缺氧環(huán)境中起到部分保護性作用。另一方面，STAT3基因rs2293152的具體作用機制尚不完全明確，對亞洲人群中的Meta分析顯示，STAT3基因rs2293152位點在隱性模型中與多種癌癥的發(fā)生有顯著性關聯(lián)(OR=1.19，95%CI=1.02-1.38)[16]。GTEx數(shù)據(jù)庫顯示，STAT3基因rs2293152位點“GG”基因型在左心室和垂體中的表達存在差異，該位點可能間接影響左心室射血分數(shù)，導致血容量發(fā)生一定變化，從而影響血氧含量。而垂體能調(diào)節(jié)雌激素分泌，雌激素在慢性缺氧條件下對紅細胞生成的調(diào)節(jié)有重大影響[17]，這種影響對HAPC可能發(fā)揮某種遏制作用。

當促紅細胞生成素與其受體結合時，受體相關JAK2信號通路會激活STAT5，使應激性紅系組細胞增殖與分化[18]。STAT5A/B是一個緊密相關的染色體并列基因編碼，這兩種蛋白在正常的造血過程中都起著重要作用。其中STAT5A的磷酸化水平?jīng)Q定了紅細胞生成的速率，進而調(diào)節(jié)紅細胞生成，對造血干細胞的增殖和轉化起到一定的調(diào)節(jié)作用[19]。此外，STAT5A可以促進增殖蛋白的產(chǎn)生和釋放，刺激內(nèi)皮細胞遷移，促進血管生成[20]。這種STAT5A效應可能參與了HAPC相關血管生成功能通路的激活。本研究暫未發(fā)現(xiàn)STAT5A基因與HAPC患病風險顯著相關的SNP位點，其原因可能是STAT5的高度活化雖然主要導致紅細胞生成，但這種效應的持續(xù)性或較為短暫。RUNDC3B基因編碼Rap2互作蛋白-9，其功能尚不明確，在正常的睪丸、腎上腺和大腦中呈高水平表達，而在正常乳腺中則呈低水平表達[21]。RUNDC3B基因的表達水平與孕激素的表達水平呈顯著正相關[22]，乳腺惡性上皮細胞RUNDC3B的活化隨侵襲性表型的進展而增加[21]，這種過表達與乳腺惡性腫瘤預后不良相關。此外，RUNDC3B基因位于ABCB1基因的擴增子區(qū)域，由ABCB1基因的互補DNA鏈轉錄而來，可能干擾ABCB1基因啟動子調(diào)控的交替調(diào)控[23]。本研究發(fā)現(xiàn)的RUNDC3B基因SNPs與HAPC患病風險不相關，這可能是由于RUNDC3B基因恰好位于ABCB1基因的特殊位置，ABCB1基因削弱或抵消了前者促進紅細胞生成的作用。

綜上所述，STAT3基因rs2293152位點可能作為保護因素，參與西藏世居高原人群HAPC發(fā)生過程，對HAPC的發(fā)展起到一定的遏制性作用。