袁志麗，徐保華，杜文貞，楊楠，張曉，司君圣

（山東省煙臺市開發(fā)區(qū)業(yè)達(dá)醫(yī)院 消化內(nèi)科，山東 煙臺 264000）

0 引言

人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）基因定位于5p15.33，為單拷貝基因，全長約41Kb，hTERT 是端粒酶中起催化作用的亞單位，通常被作為調(diào)控端粒酶活性的限速步驟而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[1]。多項研究證實(shí)，hTERT 基因的多個SNP 位點(diǎn)與多種腫瘤發(fā)生有關(guān)，如神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肺癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌、食管癌等[2-9]。目前有關(guān)hTERT 單核苷酸多態(tài)性在結(jié)腸癌發(fā)病過程中的作用尚鮮有相關(guān)報道。本研究擬采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）分析方法對結(jié)腸癌、結(jié)腸腺瘤、健康體檢者h(yuǎn)TERT 基因rs2853676 和rs2853677 位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性的分布進(jìn)行調(diào)查，結(jié)合分析其與結(jié)腸癌臨床病理參數(shù)關(guān)系，探索與結(jié)腸癌易感性關(guān)系及增值侵襲發(fā)病過程中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2017年1月-2018年12月在煙臺業(yè)達(dá)醫(yī)院內(nèi)鏡活檢或術(shù)后組織病理確診為結(jié)腸癌186例、結(jié)腸腺瘤194例為病例組，以煙臺地區(qū)無腫瘤病史、健康體檢行結(jié)腸鏡檢查未見明顯異常健康者406例為對照組，按性別和年齡（±5 歲）與病例組匹配。收集研究對象外周血標(biāo)本2mL，并進(jìn)行面訪調(diào)查，包括詳細(xì)的人口學(xué)資料、吸煙、飲酒及腫瘤病史等內(nèi)容。

納入標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均知情且同意；所有研究對象均為漢族。病例組排除合并其他系統(tǒng)或器官惡性腫瘤者，綜合結(jié)腸癌患者組織病理、腹部CT 或磁共振結(jié)果進(jìn)行臨床分期，結(jié)腸腺瘤組排除增生性、炎性及錯構(gòu)瘤性息肉者。該研究獲得煙臺業(yè)達(dá)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書。

1.2 DNA 提取

選用廣東東勝生物科技有限公司提供的外周血DNA 提取試劑盒提取白細(xì)胞DNA，紫外分光光度計檢測DNA 含量及質(zhì)量，OD260/OD280 均位于1.6～1.8，含量80～120ng/μL 視為合格，-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 基因型分析

采用PCR-RFLP 進(jìn)行基因多態(tài)性檢測。

使用primer premier 5.0 引物設(shè)計軟件，按照引物設(shè)計基本原則設(shè)計各位點(diǎn)引物，并于基因全序列內(nèi)核對，避開變異位點(diǎn)，提高擴(kuò)增片段特異性，引物由上海生工生物有限公司合成。PCR 反應(yīng)體系均采用15μL 反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min，然后進(jìn)行35 個循環(huán)：94℃變性30s，分別以59.5℃、64.0℃退火30s，72℃延伸45s，終末以72℃延伸10min，擴(kuò)增的DNA 片段長度分別為501bp、404bp，凝膠電泳及隨機(jī)抽取部分?jǐn)U增產(chǎn)物基因測序?qū)CR 擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定質(zhì)控。對rs2853676、rs2853677 位點(diǎn)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物分別采用限制性內(nèi)切酶NaeI、FauI 進(jìn)行酶切，凝膠電泳觀察DNA 條帶分析基因型。隨機(jī)抽取10%樣本雙向測序驗證，測序結(jié)果與酶切結(jié)果均一致。

1.4 觀察指標(biāo)

病例組和對照組一般信息比較。hTERT 基因SNP 位點(diǎn)基因型分布及其與結(jié)腸癌易感性關(guān)系。rs2853677 位點(diǎn)基因多態(tài)性與結(jié)腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計學(xué)軟件，采用χ2檢驗進(jìn)行Hardy-Weinberg 平衡檢驗。以t檢驗和χ2檢驗比較人口學(xué)特征和位點(diǎn)基因型在病例組與對照組之間頻率分布差異，以O(shè)R（odds radio）值及95%置信區(qū)間（CI）表示相對危險度，以P＜0.05（雙側(cè)）為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

病例組和對照組的年齡和性別構(gòu)成差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明病例對照匹配合適，吸煙及飲酒無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。

表1 病例組與對照組一般情況

2.2 遺傳平衡檢驗

經(jīng)χ2檢驗，所選各組樣本均符合Hardy-Weinberg 平衡，具有群代表性。

2.3 hTERT 各SNP 位點(diǎn)基因型分布

（1）rs2853676 位點(diǎn)各基因型在對照組、結(jié)腸腺瘤組及結(jié)腸癌組中分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。rs2853677 位點(diǎn)結(jié)腸癌組CC 基因型分布頻率（17.74%）明顯高于對照組（8.62%），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）,較結(jié)腸腺瘤組（10.30%）差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。攜帶CC 基因型者罹患結(jié)腸癌風(fēng)險增加2.193倍（95%CI：1.287-3.373），（如表2 所示）。各位點(diǎn)PCR-RFLP 酶切電泳圖如圖1、圖2 所示。rs2853677 位點(diǎn)結(jié)腸腺瘤組+結(jié)腸癌組TT、TC、CC 基因型分布頻率分別為52.37%、33.68%、13.95%，與對照組相比CC 基因型分布差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.028），OR=1.682（95%CI：1.053-2.685）。

圖1 hTERT rs2853676 位點(diǎn)PCR-RFLP 酶切電泳圖

圖2 hTERT rs2853677 位點(diǎn)PCR-RFLP 酶切電泳圖

表2 hTERT 基因SNP 位點(diǎn)基因型分布及其與結(jié)腸癌易感性關(guān)系

（2）rs2853677 位點(diǎn)基因多態(tài)性與結(jié)腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系。rs2853677 位點(diǎn)CC 基因型可顯著增加結(jié)腸癌患病風(fēng)險，我們進(jìn)一步對該位點(diǎn)基因多態(tài)性與結(jié)腸癌臨床病理參數(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示該位點(diǎn)各基因型分布頻率與結(jié)腸癌患者的性別、年齡、腫瘤分化程度差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見表3。

表3 rs2853677 位點(diǎn)基因多態(tài)性與結(jié)腸癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

3 討論

結(jié)腸癌的病因尚未完全清楚，目前認(rèn)為主要是環(huán)境與遺傳因素綜合作用的結(jié)果。近年研究發(fā)現(xiàn)hTERT在正常細(xì)胞中不表達(dá)，而在包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的約90%的腫瘤細(xì)胞中表達(dá)水平明顯增高[10]，亓玉琴等[11]研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌組織及外周血hTERT mRNA 表達(dá)明顯升高，并與結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移有關(guān)。多項全基因組關(guān)聯(lián)研究（GWAS）表明，hTERT 有多個單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)與多種腫瘤易感性有關(guān)，包括神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肺癌、乳腺癌、肝癌、卵巢癌、食管癌等多種惡性腫瘤，與結(jié)直腸癌遺傳易感性尚鮮有報道。

rs2853676位點(diǎn)定位于hTERT 第2內(nèi)含子，Shete 等[12]進(jìn)行的GWAS 表明，該位點(diǎn)與膠質(zhì)瘤風(fēng)險有關(guān)。2016年，He 等[2]對西安地區(qū)膠質(zhì)瘤患者研究發(fā)現(xiàn)“A/G”基因型降低了進(jìn)展生存率，與基因型G/G 相比，“A/A+A/G”降低了復(fù)發(fā)率，表明該位點(diǎn)多態(tài)性與中國人群中膠質(zhì)瘤的生存和復(fù)發(fā)率相關(guān)，提示其可能作為膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后標(biāo)志物。與肺癌易感性關(guān)系研究中，該位點(diǎn)表現(xiàn)出組織學(xué)異質(zhì)性，與肺腺癌顯著相關(guān)，而與鱗狀細(xì)胞癌和小細(xì)胞癌均無相關(guān)性[13]。然而，rs2853676 多態(tài)性與癌癥之間的確切功能機(jī)制仍不清楚，研究表明端粒長度會改變癌癥風(fēng)險，可能還存在該位點(diǎn)與附近其他生物潛在功能多態(tài)性或致病突變的高連鎖不平衡，此外還可能受環(huán)境風(fēng)險因素或遺傳背景影響[14]，有待進(jìn)一步研究。

rs2853677 位于hTERT 基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的第2 個內(nèi)含子+7969 堿基對上。rs2853677 T 等位基因在不同的癌癥類型間表現(xiàn)出多效性。GWAS已確定rs2853677 為日本和非洲裔美國人肺癌易感位點(diǎn)[15-16]。同一等位基因與睪丸生殖細(xì)胞腫瘤和胰腺癌呈正相關(guān)，與膠質(zhì)瘤和肺癌呈負(fù)相關(guān)[17]。Daniele 等[18]研究發(fā)現(xiàn)T 等位基因可導(dǎo)致端粒變長增加胰腺癌患病風(fēng)險。Li 等[5]研究表明rs2853677的T 等位基因是中國漢族人群對NSCLC 易感性的保護(hù)因子。此外，在另一項研究中該位點(diǎn)被確定與骨髓增生性腫瘤有關(guān)[19]。2016年一項對肺腺癌的體外功能研究發(fā)現(xiàn)，rs2853677 位于hTERT 的增強(qiáng)子功能區(qū)域，發(fā)現(xiàn)Snail1 可與增強(qiáng)子結(jié)合并重組hTERT 基因內(nèi)的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)從而抑制hTERT 轉(zhuǎn)錄，rs2853677 高危型C 等位基因破壞了Snail1 的結(jié)合位點(diǎn)，從而消除了Snail1 對hTERT 轉(zhuǎn)錄的抑制作用，表明rs2853677 通過改變轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合親和力影響hTERT 的轉(zhuǎn)錄[3,20]。本研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌組CC 基因型分布頻率較對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，結(jié)腸癌患病風(fēng)險增加2.193 倍；結(jié)腸腺瘤被看作是結(jié)腸癌的癌前病變，與結(jié)腸腺瘤組相比CC基因型分布頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，我們將二組合并后與對照組相比，發(fā)現(xiàn)TC 基因型分布頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，CC 基因型分布頻率差異仍有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.028），風(fēng)險增加1.68倍（95%：1.053-2.685），我們推測CC 基因型結(jié)腸腺瘤患者更易進(jìn)展為結(jié)腸癌，這需要進(jìn)一步的前瞻性研究證實(shí)。另外，值得注意的是2017年Li 等[21]對中國西北地區(qū)結(jié)直腸癌患者研究發(fā)現(xiàn)rs2853676、rs2853677 與結(jié)直腸癌易感性無關(guān)，rs2853677 位點(diǎn)結(jié)果與本研究不一致，這種差異可能受研究人群不同、遺傳背景差異或樣本量不足有關(guān)等因素影響，將來需要進(jìn)一步研究明確。

綜上所述，hTERT 基因rs2853676 位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性未明顯增加結(jié)腸癌患病風(fēng)險，rs2853677 位點(diǎn)CC 基因型個體罹患結(jié)腸癌的風(fēng)險性增高，該位點(diǎn)的CC 基因型可能與結(jié)腸癌遺傳易感性有關(guān)。CC 基因型結(jié)腸腺瘤患者是否更易進(jìn)展為結(jié)腸癌有待進(jìn)一步前瞻性研究證實(shí)。