李 妮 朱文勇 宋紹輝 釧鴻云 吳雅楠 趙蕊蕊 廖國陽

甲型和乙型流感病毒引起的季節(jié)性流感每年在全球可造成(300～500)萬例重癥病例以及數(shù)千人死亡，警示我們開發(fā)流感病毒疫苗勢在必行[1, 2]。接種疫苗是預(yù)防流感最有效的手段，且由于流行毒株每年可能發(fā)生不可預(yù)測的變化，流感疫苗需要每年進(jìn)行接種[3～8]。目前，美國食品和藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)的流感疫苗主要有3類，即裂解滅活流感疫苗、重組流感疫苗和減毒活疫苗[9]。其中，季節(jié)性流感疫苗主要采用雞胚進(jìn)行生產(chǎn)，含有雞胚來源的雜蛋白，所以雞蛋過敏人群被禁止接種流感疫苗[10]。卵清蛋白(ovalbumin，OVA)是雞胚中含量最高的蛋白，具有強(qiáng)免疫原性，疫苗中卵清蛋白含量過高會導(dǎo)致不良反應(yīng)并降低機(jī)體對疫苗的耐受性。最近的一項研究表明，大多數(shù)雞蛋過敏患者也可以安全地接種含有少量OVA的流感疫苗[11]。故降低疫苗中卵清蛋白含量是提高疫苗安全性和耐受性的關(guān)鍵因素。以往對卵清蛋白定量常采用 RPHA、單向免疫擴(kuò)散(SRID)、常規(guī)免疫電泳和對流免疫電泳法，但這些方法操作繁瑣，敏感度低，不適于準(zhǔn)確定量[12～14]。德國賽樂美診斷有限公司研制的OVA定量檢測試劑盒Serazym?Ovalbumin操作簡便，敏感度高，是國內(nèi)外主要采用的檢測方法。但該試劑盒檢測成本較高，不適于在生產(chǎn)工藝中推廣應(yīng)用。故研制一種操作簡單、敏感度高、成本低廉的OVA定量檢測試劑盒對于雞胚流感疫苗生產(chǎn)是十分必要的。

本研究描述了一種定量檢測OVA含量的雙抗體夾心ELISA方法，該方法具有高度特異性及敏感度，且成本低廉，可應(yīng)用于雞胚流感疫苗生產(chǎn)中OVA含量的測定，為雞胚流感疫苗研發(fā)中的質(zhì)量控制提供了支持。

材料與方法

1.主要材料及儀器設(shè)備：辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗卵清蛋白多克隆抗體(PA1-196-HRP)購自美國Thermo Fisher公司；雞卵清蛋白參考品原料(A5503-1G)(純度≥98%)購自美國Sigma公司，賽樂美卵清蛋白定量檢測試劑盒Serazym?Ovalbumin購自德國賽樂美診斷有限公司；酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad公司；隔水式恒溫培養(yǎng)箱購自美國Thermo Fisher公司。

2.實驗動物：清潔級雌性新西蘭大白兔，體質(zhì)量為2.5～3.0kg，購自昆明醫(yī)科大學(xué)。

3.參考品制備：購自美國Sigma的高純度卵清蛋白參考品原料采用稱重法配制成1.0μg/ml的儲液，用購自德國賽樂美的卵清蛋白試劑盒對該參考品濃度進(jìn)行驗證后再分別稀釋至20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.313ng/ml。

4.兔多克隆抗體的純化：采用Protein G親和層析柱對兔抗OVA血清進(jìn)行純化，獲得兔多抗IgG。親和層析操作由AKTApurifier層析系統(tǒng)實現(xiàn)，純化過程中收集流出液和洗脫液樣品，通過監(jiān)控280nm波長處的吸收度(mAU)值來確定收集抗體的時間。對收集到的抗體采用間接ELISA方法測定效價，采用SDS-PAGE測定純度，采用BCA蛋白定量試劑盒測定濃度。

5.雙抗體夾心ELISA檢測方法的建立：按以下步驟進(jìn)行雙抗體夾心ELISA實驗。捕獲抗體100微升/孔包被酶標(biāo)板，4℃孵育過夜；PBST洗板3次并拍干，加入封閉液(含質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%BSA的PBS)，250微升/孔封閉酶標(biāo)板，37℃孵育2h；PBST洗板3次并拍干，100微升/孔加入抗原，37℃孵育1h；PBST洗板3次并拍干，100微升/孔加入酶標(biāo)抗體，37℃孵育1h。顯色：洗板5次并拍干，100微升/孔加入TMB顯色液，37℃避光孵育15min；加入終止液(2mol/L H2SO4)，50微升/孔，酶標(biāo)儀檢測450nm波長處A值。

6.方法優(yōu)化：(1)捕獲抗體及酶標(biāo)抗體濃度的確定：采用棋盤滴定法，將捕獲抗體稀釋至4、3、2.5、2μg/ml包被酶標(biāo)板，以濃度為20ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對照，PBS作為陰性對照，酶標(biāo)抗體稀釋至濃度為0.5、0.25、0.125μg/ml加入酶標(biāo)板，每種條件做兩個復(fù)孔，其余步驟同第5項。根據(jù)比較不同抗體濃度組合下，陽性對照檢測結(jié)果(P)比陰性對照檢測結(jié)果(N)的值(P/N)來確定最適抗體濃度。(2)封閉液確定：捕獲抗體及酶標(biāo)抗體均采用第6項確定的最適濃度，以濃度為20ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對照，PBS作為陰性對照，分別用不同封閉液(未封閉、PBS稀釋的1%BSA、2%BSA，1%BSA+1%蔗糖，2%BSA+2%蔗糖)于37℃封閉2h，每種條件做2個復(fù)孔，比較P/N值的大小選擇最適封閉液配方。(3)判斷標(biāo)準(zhǔn)的確定：采用優(yōu)化后的體系檢測51份陰性樣本，計算cut-off值作為判斷標(biāo)準(zhǔn)。

7.方法的驗證：(1)線性范圍及敏感度驗證：將卵清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋為20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078、0.039、0.020、0.010ng/ml進(jìn)行檢測，每個濃度設(shè)置3次重復(fù)。對標(biāo)準(zhǔn)品濃度及對應(yīng)吸光度值進(jìn)行直線回歸分析，并計算相關(guān)系數(shù)r2。根據(jù)“方法優(yōu)化”項確定的cut-off值判斷該體系的敏感度。(2)重復(fù)性驗證：板內(nèi)重復(fù)性實驗：隨機(jī)選取陰性和陽性樣本各5份同時設(shè)置空白對照組和陰性對照組，每份樣本做3個復(fù)孔，于同一塊酶標(biāo)板上檢測，計算同一份樣本板內(nèi)的變異系數(shù)[CV(%)]。板間重復(fù)性實驗：取3塊酶標(biāo)板，對上述進(jìn)行板內(nèi)重復(fù)性檢驗的樣本進(jìn)行檢測，每份樣本做3個復(fù)孔，計算同一份樣本板間的變異系數(shù)。(3)特異性驗證：用建立的方法分別對甲肝病毒、Vero細(xì)胞上清液、流感病毒、新型冠狀病毒、肺炎支原體、脫脂奶粉、0.01mol/L PBS、BSA、雞蛋蛋清、鴨蛋蛋清、鵪鶉蛋蛋清、雞胚培養(yǎng)流感病毒H3N2單價原液、雞胚培養(yǎng)流感病毒H3N2尿囊收獲液、Sigma雞卵清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、solarbio雞卵清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、賽樂美試劑盒卵清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(20ng/ml)等16份樣本進(jìn)行檢測，根據(jù)“方法優(yōu)化”項確定的cut-off值驗證該方法的特異性。(4)準(zhǔn)確度驗證：隨機(jī)選取4個批次的流感病毒裂解疫苗半成品用建立的方法和購自賽樂美的卵清蛋白檢測試劑盒進(jìn)行檢測，比較建立的方法檢測結(jié)果與試劑盒檢測結(jié)果符合率，評價建立的方法檢測樣本的準(zhǔn)確性。(5)穩(wěn)定性驗證：從來自雞胚流感裂解疫苗生產(chǎn)工藝的樣本中選擇強(qiáng)陽性樣本、弱陽性樣本和陰性樣本各3份。用該方法預(yù)包被后于-20℃凍存1周、1個月、3個月及6個月的酶標(biāo)板對上述樣本進(jìn)行穩(wěn)定性試驗。

結(jié) 果

1.兔抗OVA血清純化驗證結(jié)果：經(jīng)Protein G層析柱親和層析可有效分離血清中的雜蛋白(圖1中a～b段)，收集獲得高純度的IgG抗體(圖1中c～d段)。對收集的抗體進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果顯示只有相對分子質(zhì)量為57.92kDa和35.44kDa的重鏈、輕鏈各一條，表明親和層析純化后得到了純度較高的兔抗OVA多抗(圖2)。間接ELISA方法測得多抗的效價為1∶64000，BCA法測得蛋白濃度為12.0mg/ml。

圖1 純化兔抗OVA血清的親和層析圖譜a～b.流穿峰；c～d.洗脫峰

圖2 兔抗OVA血清親和層析純化后SDS-PAGE電泳圖1.收集的洗脫液；M.蛋白marker

2.方法優(yōu)化的結(jié)果：(1)最適捕獲抗體和酶標(biāo)抗體濃度：當(dāng)捕獲抗體濃度為2.5μg/ml，酶標(biāo)抗體濃度為0.5μg/ml，P/N值最大，為38.483。故選擇捕獲抗體及酶標(biāo)抗體最適工作濃度分別為2.5μg/ml和0.5μg/ml(表1)。(2)最適封閉液：當(dāng)用1%BSA+1%蔗糖封閉時，P/N值較大，為45.526，故選擇1%BSA+1%蔗糖作為最適封閉液配方(表2)。(3)判斷標(biāo)準(zhǔn)的確定：51份陰性樣本檢測結(jié)果平均值為0.065，標(biāo)準(zhǔn)差為0.023，在要求99%(單側(cè))可信度條件下，采用以吸光度均值+3倍標(biāo)準(zhǔn)差作為陽性判斷值[15]。計算得cut-off值為0.134，故檢測結(jié)果>0.134時判斷為陽性，檢測結(jié)果≤0.134則判為陰性。

表1 捕獲抗體和酶標(biāo)抗體工作濃度優(yōu)化結(jié)果

表2 封閉液優(yōu)化結(jié)果

3.方法驗證的結(jié)果：(1)線性范圍及敏感度驗證結(jié)果：5次實驗繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線均表明，當(dāng)卵清蛋白濃度為20.000ng/ml到0.313ng/ml，A450值與樣品濃度呈良好的線性關(guān)系，且回歸系數(shù)r2均大于0.97，且重復(fù)性好(圖3)。并根據(jù)cut-off值確定該檢測方法的檢測下限為0.078ng/ml。(2)重復(fù)性驗證結(jié)果：板內(nèi)最大CV值為25.953%，最小為3.428%；板間最大CV值為27.614%，最小為5.375%，表明該方法具有較高的重復(fù)性(表3)。(3)特異性驗證結(jié)果：對已知背景的16份樣本進(jìn)行檢測，檢出陽性樣本8份，陰性樣本8份，與已知背景相符，表明該方法具有較高的特異性。(4)準(zhǔn)確度驗證結(jié)果：采用本方法與購自德國賽樂美的卵清蛋白試劑盒對4份H1N1流感疫苗半成品進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，該方法檢測結(jié)果與試劑盒檢測結(jié)果符合率為91.43%～102.96%，二者比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明建立的檢測方法具有較高的準(zhǔn)確度(表4)。穩(wěn)定性驗證結(jié)果：用凍存不同時間的預(yù)包被酶標(biāo)板對上述樣本進(jìn)行檢測，變異系數(shù)為1.976%～ 14.409%，表明該方法具有較高的穩(wěn)定性(表5)。

表3 板內(nèi)及板間重復(fù)性驗證

表4 準(zhǔn)確度驗證

表5 穩(wěn)定性驗證

圖3 雙抗體夾心ELISA定量OVA的標(biāo)準(zhǔn)曲線

討 論

疫苗是控制流感病毒感染傳播最經(jīng)濟(jì)有效的手段，季節(jié)性流感疫苗主要采用雞胚生產(chǎn)。研究表明，OVA可導(dǎo)致炎性細(xì)胞侵入呼吸道，引起雌性BALB/c小鼠脂質(zhì)過氧化從而引起DNA損傷，以及誘導(dǎo)細(xì)胞完整性損傷導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙[16,17]。故降低疫苗中OVA含量對于提高疫苗的安全性和免疫原性至關(guān)重要。以往對卵清蛋白定量的方法具有操作繁瑣、成本高昂、敏感度低等問題，與傳統(tǒng)方法比較，利用雙抗體夾心ELISA方法進(jìn)行檢測具有以下明顯優(yōu)勢：(1)檢測敏感度高，檢測可達(dá)到納克級別。(2)操作簡便，預(yù)包被酶標(biāo)板可在-20℃長期保存，單次檢測操作可在3h內(nèi)完成。(3)價格低廉，可大大節(jié)約檢測成本。故雙抗體夾心ELISA檢測方法可對雞胚流感病毒疫苗及工藝階段樣品中OVA進(jìn)行定量檢測。

本研究通過制備兔抗OVA多克隆抗體，建立了一種快速、簡便、低成本的雙抗體夾心ELISA檢測方法，并進(jìn)行了驗證。采用純化后的多克隆抗體作為捕獲抗體，避免了血清中雜蛋白造成的交叉反應(yīng)，有助于提高檢測的敏感度和準(zhǔn)確度。另外，直接采用帶有辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗OVA多克隆抗體作為檢測抗體，與采用酶標(biāo)二抗比較，節(jié)約了操作時間，且避免了酶標(biāo)二抗導(dǎo)致的交叉反應(yīng)。對該方法的準(zhǔn)確性、敏感度、重復(fù)性和特異性進(jìn)行了驗證，敏感度高，重復(fù)性好，特異性強(qiáng)，檢測準(zhǔn)確度不低于德國賽樂美卵清蛋白定量檢測試劑盒，可用于雞胚流感疫苗中卵清蛋白定量檢測。但ELISA方法采用酶聯(lián)免疫進(jìn)行反應(yīng)，特異性和敏感度有一定局限，而隨著納米材料在醫(yī)學(xué)研究中的進(jìn)一步應(yīng)用，金納米顆粒在提高ELISA分析的敏感度和特異性方面也展現(xiàn)出重要作用，筆者也希望通過引入金納米顆?；蚩砷_發(fā)出更高敏感度和特異性的卵清蛋白定量檢測方法[18]。