莊 彪 閔志均 倪 熊 王廷峰 吳德俊 崔 鵬

結腸直腸癌(carcinoma of colon and rectum，CRC)是世界上第三大常見的癌癥與第四大死亡原因的胃腸道惡性腫瘤，其具有高復發(fā)率和高致死率的特點[1～5]。研究表明不良飲食習慣、腸道炎癥、腸息肉、遺傳、年齡等增加患癌風險，并且年輕患者侵襲更強[6,7]。如何探索結直腸癌新的作用機制開發(fā)新的療法成為研究的新方向。長鏈非編碼 RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一種超過200個核苷酸且不翻譯成蛋白質(zhì)的轉錄本，且被認為沒有生物學功能的轉錄“噪聲”[8,9]。研究表明，在腫瘤中其參與增殖、凋亡、遷移、侵襲、轉移等過程[10,11]。本研究通過生物信息學篩選發(fā)現(xiàn)lncRNA-AK126393與結直腸癌自噬相關，并在結直腸癌細胞中進行表達鑒定，進一步干預其表達探討其在結直腸癌中的作用機制。

材料與方法

1.實驗材料：MonAmpTMSYBR?Green qPCR Mix(MQ10301S，蘇州莫納生物科)；PrimeScript RT Master Mix (RR036A，日本TaKaRa公司)；RNAiso Plus(9109，日本TaKaRa公司)；Annexin V-FITC/PI apoptosis kit(70-AT101-100，杭州聯(lián)科生物技術股份有限公司)；Cell cycle staining kit(70-CCS012，杭州聯(lián)科生物技術股份有限公司)；Lipofectamine TM 2000(11668030，美國Invitrogen公司)；Fetal Bovine Serum(10099141，美國Gibco公司)；RPMI1640培養(yǎng)基(31870082，美國Gibco公司)；Bcl2(cst- 3498)、Bax(cst- 2774)、PI3K(cst- 4249)、P-PI3K(cst- 13857)、Akt(cst- 9272)、P-Akt(cst- 4060)、LC3(cst- 12741)和GAPDH(cst-5174)購自美國Cell Signaling Technology公司；質(zhì)粒構建、引物合成、二抗等常用生化試劑購自生工生物工程(上海)股份有限公司；人結直腸癌細胞系HCT-116、SW480、SW620和正常人結腸組織細胞CCD-18CO購自上海富衡生物科技有限公司;槍頭、細胞培養(yǎng)板等常用耗材購自無錫耐思生命科技股份有限公司。

2.實驗方法：(1)細胞培養(yǎng)和轉染：人結腸癌細胞系和正常人結腸組織細胞培養(yǎng)均用10%FBS+1%雙抗的RPMI164完全培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，靜置于37℃的恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，當細胞密度超過80%后進行消化傳代接種，按105個/孔的密度將細胞接種與6孔板中，細胞轉染按照Lipofectamine TM 2000轉染試劑說明書進行操作。AK126393片段全長合成并構建真核表達質(zhì)粒委托工生物工程(上海)股份有限公司完成，使用Lipofectamine TM 2000將pcDNA3.1-AK126393質(zhì)粒和pcDNA3.1空載體分別轉染進入細胞，轉染6h后更換正常完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。(2)qRT-PCR：經(jīng)過轉染處理后細胞，根據(jù)RNAiso Plus說產(chǎn)品說明書提取總RNA，并應用RT Master Mix適合對總RNA進行反轉錄，使用SYBR Green qPCR Mix進行qRT-PCR擴增。擴增條件為：95℃ 5min、95℃ 10s、60℃ 30s的40個擴增循環(huán)的熱循環(huán)參數(shù)進行qPCR，靶基因引物序列如下：AK126393-上游引物：5′-TAAAGCTCCCGATGCCAGAC-3′，AK126393-下游引物：5′-GCCAACCTGATGTCCTTGGA-3′；GAPDH-上游引物：5′-GAGGCTGGGAACCTTAAGGT-3′，GAPDH-下游引物:5′-AGGGCCGCTGGTCAGAA-GTT-3′。靶基因的表達水平用△Ct歸一化，相對倍數(shù)變化用2-△△Ct。(3)CCK-8檢測：各組細胞以104個/孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，在接種后繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72和96h后進行增值檢測。每孔加入10μl CCK-8溶液繼續(xù)培養(yǎng)1h，用酶標儀測定樣本在450nm出的吸光度。(4)流式細胞術：將各組細胞用胰酶消化并收集各組細胞，根據(jù)Annexin V-FITC/PI apoptosis kit和Cell cycle staining kit試劑盒廠商說明書進行細胞染色處理后用Cytoflex流式細胞儀檢測個組細胞凋亡和周期變化。(5)Western blot法：將培養(yǎng)板中的各組細胞加入蛋白裂解液及PMSF進行提取細胞總蛋白，并用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。取20μl蛋白樣品加載到10%的分離膠上，并通過電泳分離蛋白質(zhì)。然后將分離后的蛋白質(zhì)轉移到PVDF膜上，加入封閉液37℃封閉1h；將膜與LC3、Bax、Bcl2、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、GAPDH抗體4℃過夜孵育。TBST反復洗膜3次后，將膜與辣根過氧化物標記的二抗孵育，室溫輕搖1h，洗膜后，入顯色液顯色并拍攝分析。

結 果

1.lncRNA AK126393在正常人結腸組織細胞和結直腸癌細胞系的表達：與正常人結腸組織細胞系(CCD-18CO)比較，lncRNA AK126393在結直腸癌細胞系(HCT116、SW620、SW480)中異常低表達(P<0.05)，其中SW480細胞中表達量最低(P=0.000，圖1)。

圖1 AK126393在正常人結腸組織細胞和結直腸癌細胞系的表達與CCD-18CO細胞比較，*P<0.05，** P<0.01，***P=0.000

2.在SW480細胞中AK126393過表達質(zhì)粒的轉染效率：在轉染陰性質(zhì)?？蛰d體和AK126393過表達質(zhì)粒后SW480細胞中的AK126393的相對表達量為1.05±0.05和2.56±0.21(P<0.01，圖2)。

圖2 AK126393在SW480細胞中的相對表達水平與NC組細胞比較，*P<0.01

3.過表達AK12639對SW480細胞增殖的影響：CCK8檢測結果顯示， AK126393過表達組細胞活力出現(xiàn)顯著下降(P<0.05，圖3A)，在流式周期檢測試驗中，觀察到一致的數(shù)據(jù)(圖3B)。

圖3 AK126393過表達抑制SW480細胞增殖A.轉染0、24、48、72、96h后，通過CCK8測定法測定SW480細胞的細胞活力；B.轉染24h后，通過流式細胞周期法測量SW480細胞的細胞周期。與NC組比較，*P<0.05，**P<0.01

4.AK126393過表達對人結腸癌細胞凋亡和自噬的影響：流式細胞術檢測結果顯示，AK126393過表達組細胞凋亡比例顯著增加(圖4A)；Western blot法檢測結果顯示凋亡蛋白Bax表達增高，而抗凋亡蛋白Bcl-2表達降低，同時發(fā)現(xiàn)自噬蛋白LC3-Ⅰ降低，LC3-Ⅱ增高(圖4B)。

圖4 AK126393過表達對SW480細胞凋亡和自噬的影響A.流式細胞儀測定細胞凋亡；B.Western blot法檢測Bcl-2、Bax和LC3蛋白表達。與NC組細胞比較，*P<0.05，**P<0.01

5.AK126393過表達抑制PI3K/Akt信號通路：Western blot法檢測結果如圖5顯示，與NC組相比較，AK126393過表達組細胞中PI3K和Akt的磷酸化水平顯著降低，而總PI3K和總Akt的表達無變化。

圖5 AK126393過表達對SW480細胞中PI3K/Akt通路的作用與NC組細胞比較，*P<0.05

討 論

研究表明，lncRNA的表達異常影響細胞穩(wěn)態(tài)的的各個方面，如生存，增殖、遷移和基因組穩(wěn)定性等，并且多種lncRNA的表達異表達與腫瘤的惡性轉化和預后不良有關[12～14]。隨著二代測序技術的發(fā)展與進步，越來越多的lncRNA的異常表達與不同類型的癌癥有關得到證實[15]。AK126393是高通量篩發(fā)現(xiàn)的一種新型的與癌癥相關的lncRNA，位于染色體10q26，在結腸癌組織中異常低表達，被認為是具有抑制腫瘤作用的分子[16]，而其用機制不清楚。因此，筆者在細胞系中檢測了AK126393表達，結果與先前的文獻分析相符。為了進一步證實，筆者通過過表達SW480細胞，結腸癌細胞增值收到抑制、凋亡增加并發(fā)生了自噬現(xiàn)象。lncRNA在腫瘤細胞中的調(diào)控作用復雜，通常與腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲和自噬等生物學行為有關。例如，lncRNA TUG1調(diào)控miRNA-145促進結腸癌細胞增殖、遷移和侵襲，lncRNA HULC促進肺癌細胞增殖與提高肺癌細胞自噬水平,且與自噬相關蛋白ATG7相關[17,18]。

PI3K/Akt廣泛分布在細胞中，許多反定義RNA影響細胞表型的調(diào)控都是通過PI3K/Akt途徑實現(xiàn)的，如調(diào)節(jié)細胞增、分化、凋亡和代行等[19～21]。本研究中筆者提出AK126393抑制PI3K/Akt新思路，為明確AK126393在結腸癌細胞系調(diào)控的作用提供了支持。PI3K是具有催化活性的胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，在多種人類癌癥中通常由于基因擴增和體細胞點突變而失調(diào)[22]。Akt是PI3K下游的靶向調(diào)節(jié)分子，在維持細胞活和凋亡中起到重要功能蛋白，因為它激活多種酶和轉錄因子來調(diào)節(jié)細胞功能[23]。研究表明，在腫瘤增殖、凋亡、侵襲、耐藥的方面p-Akt蛋白起著重要的作用，是重要促進因子[24,25];在抗癌藥物研發(fā)方向Akt的活化抑制是重要研究途徑之一[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)AK126393在SW480細胞中表達能抑制其增殖、促進其凋亡并引起細胞自噬；并且發(fā)現(xiàn)其PI3K和Akt的磷酸蛋白化水平顯著降低，PI3K和Akt總蛋白無明顯變化。從而證明AK126393可以通過PI3K/Akt通路的激活抑制來實現(xiàn)抗癌作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，在結直腸癌細胞中l(wèi)ncRNA AK126393具有抑制細胞增殖、促進凋亡以及引起細胞自噬的作用。此外證實，lncRNA AK126393通過抑制PI3K/Akt途徑激活來實現(xiàn)誘導結腸癌細胞凋亡。因此，lncRNA AK126393為今后結腸癌的診治提供新的潛在靶標。