王艷玲，楊存敏，李海霞

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院，河北 張家口 075000)

食管癌作為常見消化道惡性腫瘤，主要可分為食管鱗狀細(xì)胞癌、食管腺癌兩類，相關(guān)報道指出，歐美國家以后者發(fā)病較為多見，而國內(nèi)主要以食管鱗狀細(xì)胞癌較為多見[1～3]。目前大部分食管鱗癌患者在初次確診時病情已進(jìn)展至中晚期，相關(guān)治療措施實施較晚，導(dǎo)致患者在5年內(nèi)生存期情況不佳[4]。相關(guān)研究顯示，在腫瘤患者病灶組織及體液內(nèi)存在大量長鏈非編碼RNA(IncRNA)，可作為促癌或促癌基因調(diào)控腫瘤下游基因蛋白表達(dá)，參與胃癌、腸癌、膀胱癌、食管癌等多種惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移，其中腫瘤抑制候選基因-7(TUSC7)在癌組織中呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài)[5]，可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，亦可通過與miR-211、p53等抑癌因子相結(jié)合加速腫瘤進(jìn)展。此外，叉頭框轉(zhuǎn)錄因子M1(Foxm1)、鱗狀細(xì)胞癌抗原(SCC-Ag)在一系列惡性鱗狀細(xì)胞癌中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)[6，7]，可參與部分肺癌、宮頸癌的早期診斷，反映腫瘤進(jìn)展情況。本研究探討LncRNATUSC7、Foxm1、SCC-Ag在不同分期食管癌患者中的表達(dá)情況及意義，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料2019年1月至2020年6月我院收治的78例食管癌患者，納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理檢查、食管鋇餐、胃鏡等方式確診為原發(fā)性食管癌者；②均接受本次研究所涉及指標(biāo)的檢查。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他類型腫瘤者；②臨床資料保存不完整者。根據(jù)腫瘤分期分為早中期組(TNM分期Ⅰ～Ⅱ期)32例與中晚期組(TNM分期Ⅲ～Ⅳ期)46例。男46例，女32例；年齡37～75歲[(53.63±9.52)歲]；TNM分期：Ⅰ期10例，Ⅱ期22例，Ⅲ期35例，Ⅳ期11例；78例均為鱗癌。

1.2 方法收集癌組織標(biāo)本，對食管鱗癌細(xì)胞株及正常食管上皮細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，以10%胎牛血清、1%雙抗RPIM 1640完全培養(yǎng)液在5%CO2、37 ℃條件下的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)實施培養(yǎng)。①TUSC7基因序列依據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)相關(guān)記錄獲得[8]，設(shè)計擴(kuò)增引物；②采用Trizol法、血清RNA提取法對食管鱗癌細(xì)胞株及血清中總RNA進(jìn)行測定，通過電泳法對RNA完整度進(jìn)行檢測；③采用核酸蛋白測定儀對RNA濃度進(jìn)行測定，篩選A260/280值在1.8～2.1、總RNA濃度在210 ng/μl以上的良好樣本于-80 ℃下進(jìn)行保存；④采用Primer premier 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計；⑤將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并于-20 ℃下保存，qPCR擴(kuò)增過程中需以Gapdh作為內(nèi)參，cDNA作為模板，反應(yīng)參數(shù)設(shè)置為95 ℃預(yù)變性1 min、95 ℃10 s、64 ℃30 s、72 ℃30 s共40個循環(huán)，并于72 ℃下進(jìn)行5 min延伸；⑥采用2-△△Ct相對定量法測定TUSC7基因相對表達(dá)值；⑦Foxm1水平測定采用上述相同RNA濃度測定方法及引物設(shè)計軟件，將β-actin作為內(nèi)參，反應(yīng)參數(shù)設(shè)置為95 ℃預(yù)變性2 min、95 ℃15 s、60 ℃45 s共40個循環(huán)；⑧采用2-△△Ct相對定量法計算基因表達(dá)值。同時采集所有患者外周靜脈血5 ml，采用全自動生化分析儀對SCC-Ag水平進(jìn)行測定。

1.3 觀察指標(biāo)比較兩組LncRNATUSC7、Foxm1、SCC-Ag表達(dá)水平；分析其表達(dá)水平與腫瘤分期的相關(guān)性；評估三項指標(biāo)對食管癌患者腫瘤分期評估效能。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 21.0軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料比較采用t檢驗；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析；診斷效能分析采用ROC曲線。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組LncRNATUSC7、Foxm1、SCC-Ag表達(dá)水平比較中晚期組LncRNATUSC7水平低于早中期組，F(xiàn)oxm1、SCC-Ag水平高于早中期組(P<0.05)，見表1。

表1 兩組LncRNATUSC7、Foxm1、SCC-Ag表達(dá)水平比較

2.2 LncRNATUSC7、Foxm1、SCC-Ag表達(dá)水平與食管癌腫瘤分期的相關(guān)性LncRNATUSC7水平與食管癌腫瘤分期呈負(fù)相關(guān)，F(xiàn)oxm1、SCC-Ag水平與食管癌腫瘤分期呈正相關(guān)(P<0.05)，見表2。

表2 LncRNATUSC7、Foxm1、SCC-Ag表達(dá)水平與食管癌腫瘤分期的相關(guān)性

2.3 LncRNATUSC7、Foxm1、SCC-Ag表達(dá)水平評估食管癌分期的效能分析LncRNATUSC7、Foxm1、SCC-Ag表達(dá)水平評估食管癌分期的ROC曲線AUC分別為0.914、0.871、0.795，截斷值分別為0.27、1.40、5.15 ng/ml，見圖1、表3。

圖1 LncRNATUSC7、Foxm1、SCC-Ag表達(dá)水平評估食管癌分期的ROC曲線

表3 LncRNATUSC7、Foxm1、SCC-Ag表達(dá)水平評估食管癌分期的效能分析

3 討論

食管鱗癌屬于侵襲性惡性腫瘤，臨床針對病情發(fā)現(xiàn)較晚的患者可借助手術(shù)、放射治療、輔助化療、生物治療等手段實施治療，但因腫瘤侵襲較快，易發(fā)生食道內(nèi)播散、淋巴轉(zhuǎn)移、血行轉(zhuǎn)移及手術(shù)切口轉(zhuǎn)移[9，10]，治療情況不佳，五年內(nèi)生存情況堪憂，故探尋評估腫瘤侵襲進(jìn)展情況的指標(biāo)極為必要。

上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)型(EMT)與腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移存在緊密關(guān)聯(lián)，在EMT進(jìn)展過程中，機(jī)體上皮細(xì)胞可喪失E-cadherin等連接蛋白，并補(bǔ)充Vimentin、Ncadherin等間充質(zhì)標(biāo)志蛋白。而近年來相關(guān)研究指出，IncRNA可通過對EMT過程的調(diào)節(jié)參與而參與部分腫瘤的發(fā)生發(fā)展，其促癌、抑癌基因共同發(fā)揮作用，參與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移[11]。LncRNATUSC7位處染色體3q13.31，由4個外顯子共同組成，屬于一類反義lncRNA，在骨肉瘤、非小細(xì)胞肺癌、胃癌、胰腺導(dǎo)管腺癌等多種惡性腫瘤組織中TUSC7均呈低表達(dá)狀態(tài)[12，13]，與腫瘤生長情況及惡性腫瘤的臨床病例特征及預(yù)后密切相關(guān)。本研究中，中晚期組LncRNATUSC7水平顯著低于早中期組，LncRNATUSC7水平與食管癌腫瘤分期呈負(fù)相關(guān)，提示隨著食管癌患者腫瘤分期的進(jìn)展，其LncRNATUSC7多呈現(xiàn)低表達(dá)。而ROC曲線進(jìn)一步證實其在食管癌分期評估中具有良好效能，這可能與LncRNATUSC7過度結(jié)合miR-211、miR-23b、miR-224、miR-10a等抑癌基因進(jìn)而加速EMT進(jìn)程有關(guān)。隨著抑癌基因及TUSC7水平的共同降低，腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移情況進(jìn)一步促進(jìn)。此外，LncRNATUSC7表達(dá)的降低可引起Vimentin、Ncadherin等蛋白表達(dá)水平的上調(diào)，同時下調(diào)E-cadherin連接蛋白表達(dá)，亦可促進(jìn)EMT進(jìn)程，使腫瘤遷移進(jìn)展情況得到促進(jìn)。

叉頭框(FOX)蛋白轉(zhuǎn)錄因子家族存在多個亞族，其蛋白成員作為轉(zhuǎn)錄因子可憑借對共激活因子的招募對基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用，部分家族成員可結(jié)合凝聚染色質(zhì)，并參與其重構(gòu)及轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。FOXM1作為FOX轉(zhuǎn)錄因子家族中的一員，可協(xié)同其他成員分別參與調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖、代謝、凋亡等多種重要的生理過程，近年來相關(guān)研究指出，F(xiàn)OXM1在肺鱗癌等多種鱗癌中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，其表達(dá)量與腫瘤良惡性、細(xì)胞分化程度具有先顯著相關(guān)性[14]。SCC-Ag作為一類鱗狀細(xì)胞相關(guān)抗原，被指出在多種鱗癌患者血清中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)[15]。本研究中，中晚期組Foxm1、SCC-Ag水平高于早中期組，F(xiàn)oxm1、SCC-Ag水平與食管癌患者腫瘤分期呈正相關(guān)，提示隨著腫瘤分期的進(jìn)展，食管癌患者Foxm1、SCC-Ag水平多呈現(xiàn)更高表達(dá)狀態(tài)。ROC曲線分析進(jìn)一步確認(rèn)了二者在食管癌患者腫瘤分期中的評估效能，分析其原因在于FOXM1屬于一類具備細(xì)胞生長調(diào)節(jié)功能的轉(zhuǎn)錄因子，在正常表達(dá)情況下可憑借多種基因轉(zhuǎn)錄對細(xì)胞有序分裂進(jìn)行調(diào)控，在其表達(dá)水平顯著升高后，細(xì)胞基因組紊亂程度明顯提升，從而導(dǎo)致細(xì)胞基因突變風(fēng)險上升。此外，F(xiàn)OXM1可發(fā)揮對血小板源性生長因子-A的反式激活作用，使血小板衍生生長因子受體信號通路激活，并借助該通路參與EMT過程，減少腫瘤細(xì)胞凋亡，并促進(jìn)其增殖轉(zhuǎn)移。而SCC-Ag來源于鱗狀上皮細(xì)胞癌組織，隨著機(jī)體癌組織的生長其表達(dá)水平亦可明顯上升。