劉思巧，姚俊成，顏 天，王 磊，李玉濤，楊 祺，竇 科

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院東院泌尿外科，四川 成都 610000)

勃起功能障礙(erectile dysfunction，ED)是患者無法正常勃起的疾病[1]。ED的患病率在全球呈現(xiàn)上升趨勢[2]。多種因素與ED發(fā)生相關(guān)[3]。由于勃起過程主要由充血引起，血管性因素仍是ED發(fā)生中最重要的因素[4]。而在血管性ED的情況下，由于血流灌注減少，造成陰莖海綿體內(nèi)血管及其周圍組織破壞[5]。淫羊藿是淫羊藿屬植物全草，在中國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，具有補(bǔ)腎陽的功用，其在人體中的主要活性成分是淫羊藿苷[6]。淫羊藿苷在人體內(nèi)發(fā)揮多種作用[7～9]，包括改善組織纖維化程度[10]。為了確認(rèn)ED發(fā)生時(shí)海綿體是否發(fā)生纖維化程度的增加，以及淫羊藿苷是否能改善海綿體纖維化，我們設(shè)計(jì)了本次實(shí)驗(yàn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料2020年10月至2021年2月在四川省人民醫(yī)院飼養(yǎng)的60只雄性SD大鼠，年齡8周，體重250～300 g，其飼料、飲水、飼養(yǎng)環(huán)境相同。實(shí)驗(yàn)器械：成都儀器廠產(chǎn)多通道生理記錄儀，型號(hào)RM-6240E；匈牙利3DHISTECH公司生產(chǎn)數(shù)字切片掃描儀，型號(hào)Pannoramic 250；常州派斯杰醫(yī)療設(shè)備公司生產(chǎn)的全自動(dòng)染色儀，型號(hào)RS36。

1.2 方法將60只SD大鼠通過簡單隨機(jī)抽樣分為假手術(shù)組、模型組、他達(dá)拉非組及淫羊藿苷低、中、高劑量組各10只。除假手術(shù)組外，其余5組均采取結(jié)扎雙側(cè)髂內(nèi)動(dòng)脈的方式構(gòu)建血管性ED大鼠模型[11]，在對大鼠麻醉滿意后進(jìn)入腹腔，尋找雙側(cè)髂內(nèi)動(dòng)脈后以絲線結(jié)扎其近端。假手術(shù)組僅在麻醉滿意后進(jìn)入腹腔，翻找查看雙側(cè)髂內(nèi)動(dòng)脈后，不作任何處理即縫合腹腔。完成手術(shù)后，對不同組大鼠給予不同的藥物處理。其中假手術(shù)組和模型組不予藥物處理，僅給予1 ml/d的生理鹽水灌胃；他達(dá)拉非組給予0.8 mg/kg的他達(dá)拉非灌胃；低劑量組給予20 mg/kg的淫羊藿苷飼喂，中劑量組給予40 mg/kg的淫羊藿苷飼喂，高劑量組給予80 mg/kg的淫羊藿苷飼喂。以上飼喂連續(xù)持續(xù)30天。飼喂結(jié)束后，測量大鼠最大陰莖海綿體內(nèi)壓(ICPmax)后取得大鼠陰莖海綿體標(biāo)本，對大鼠陰莖海綿體進(jìn)行冷凍后切片，每份標(biāo)本取得3份切片利用masson染色的方式對切片進(jìn)行染色。染色包括脫蠟、固定液固定后，利用苯胺藍(lán)染色液染色、蘇木素染色液、麗春紅品紅染色液、天青石藍(lán)染色液，隨后利用磷鉬酸溶液顯色和弱酸性溶液酸化。染色結(jié)束后利用數(shù)字切片掃描儀對切片進(jìn)行圖像采集。

1.3 觀察指標(biāo)①ICPmax：作為測量大鼠勃起功能的指標(biāo)。通過26G針頭刺入大鼠陰莖海綿體根部時(shí)電刺激大鼠海綿體神經(jīng)取得[12]。②纖維組織表達(dá)面積百分比：大鼠陰莖海綿體纖維組織表達(dá)面積百分比作為反映大鼠陰莖海綿體纖維化程度的指標(biāo)。通過masson染色后數(shù)字掃描切片得到。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用GraphPad Prism 5.0系統(tǒng)。計(jì)量資料多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用Tukey分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠勃起功能比較假手術(shù)組、他達(dá)拉非組、中劑量組、高劑量組高于模型組(P<0.001)；高劑量組高于他達(dá)拉非組(P<0.01)；低劑量組與模型組、高劑量組與假手術(shù)組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠ICPmax值比較

2.2 各組大鼠陰莖海綿體纖維化程度比較采用Image Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)，對取得的大鼠陰莖海綿體切片標(biāo)本進(jìn)行測圖像的光密度(IOD)和面積測定，計(jì)算纖維組織表達(dá)面積百分比。模型組陰莖海綿體纖維組織表達(dá)面積顯著大于假手術(shù)組(P<0.05)。通過對6組大鼠的陰莖海綿體纖維組織表達(dá)百分比進(jìn)行比較，模型組大于假手術(shù)組(P<0.05)，其余組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠陰莖海綿體纖維組織表達(dá)面積百分比比較 (%)

2.3 各組大鼠陰莖海綿體切片鏡下觀察通過40倍鏡下觀察，可見假手術(shù)組大鼠陰莖海綿體內(nèi)膠原纖維組織疏松，染色樣本光密度小(圖1a)；模型組大鼠陰莖海綿體內(nèi)膠原纖維交聯(lián)非常致密，占據(jù)視野中的絕大部分(圖1b)；他拉達(dá)非組大鼠陰莖海綿體內(nèi)膠原纖維較疏松，染色樣本光密度較小(圖2a)；低劑量組大鼠陰莖海綿體內(nèi)膠原纖維較致密，染色樣本光密度大(圖2b)；中劑量組大鼠陰莖海綿體內(nèi)膠原纖維較疏松，纖維交聯(lián)較疏松(圖3a)；高劑量組大鼠陰莖海綿體內(nèi)膠原纖維疏松，組織間隙大，染色樣本光密度較小(圖3b)。

圖1 假手術(shù)組和模型組大鼠陰莖海綿體40倍鏡下病理特征 a：假手術(shù)組；b：模型組

圖2 他達(dá)拉非組和低劑量組大鼠陰莖海綿體40倍鏡下病理特征 a：他達(dá)拉非組；b：低劑量組

圖3 中劑量組和高劑量組大鼠陰莖海綿體40倍鏡下病理特征 a：中劑量組；b：高劑量組

3 討論

通過傳統(tǒng)中藥淫羊藿臨床上對于治療ED的啟發(fā)，本文對于淫羊藿苷的活性成分淫羊藿苷在大鼠體內(nèi)的作用做出了探究。通過查閱文獻(xiàn)資料，確定了以雙側(cè)髂內(nèi)動(dòng)脈結(jié)扎的方式構(gòu)造大鼠血管性ED模型，作為后續(xù)研究的基礎(chǔ)。大鼠血管性ED模型也通過測量大鼠陰莖海綿體內(nèi)壓的方式得到驗(yàn)證。在后續(xù)的工作中，通過查閱文獻(xiàn)確定了不同組別大鼠的藥物飼喂?jié)舛?，并選擇他達(dá)拉非這一臨床常用改善勃起功能的藥物作為陽性對照，作為后續(xù)治療效果和機(jī)制的比較。通過對大鼠ICPmax的測量，可以對不同組大鼠的勃起功能進(jìn)行比較。其結(jié)果可以提示，雙側(cè)髂內(nèi)動(dòng)脈結(jié)扎后大鼠的勃起功能顯著降低，而他達(dá)拉非、中劑量淫羊藿苷、高劑量淫羊藿苷對于大鼠的勃起功能有顯著的改善作用，低劑量淫羊藿苷對于大鼠的勃起功能改善效果不明顯，而高劑量淫羊藿苷對于大鼠勃起功能的改善效果優(yōu)于他達(dá)拉非。在進(jìn)行大鼠陰莖海綿體纖維化程度的測量過程中，可以發(fā)現(xiàn)雙側(cè)髂內(nèi)動(dòng)脈結(jié)扎后，大鼠陰莖海綿體的纖維化程度顯著增加，提示動(dòng)脈灌注的減少能夠?qū)е潞＞d體纖維化增加，從而進(jìn)一步限制血管的充盈和勃起的發(fā)生，為ED的發(fā)生和發(fā)展提供了新的思路。通過30天的藥物飼喂，可以發(fā)現(xiàn)不同組別大鼠的陰莖海綿體纖維化程度存在一定的分布趨勢，這一分布主要呈現(xiàn)為假手術(shù)組<高劑量組<他達(dá)拉非組<中劑量組<低劑量組<模型組。但通過兩兩比較，發(fā)現(xiàn)除假手術(shù)組與模型組之間的差別顯著以外，其余的組間比較不具有明顯的差別。這一差別可能與本次實(shí)驗(yàn)中對大鼠的灌藥處理的方式和時(shí)間不同有關(guān)。通過查閱文獻(xiàn)，可以發(fā)現(xiàn)在淫羊藿苷改善大鼠肝臟纖維化的實(shí)驗(yàn)中，其飼喂時(shí)間長達(dá)8周[13]。而在淫羊藿苷改善大鼠腎臟纖維化的實(shí)驗(yàn)中，采取了對大鼠進(jìn)行淫羊藿苷靜脈注射的方式給藥，以達(dá)到更高的血藥濃度[14]。因此，本實(shí)驗(yàn)藥物處理時(shí)間較短，攝入方式需代謝轉(zhuǎn)換，可能是導(dǎo)致本實(shí)驗(yàn)中能觀察到淫羊藿苷在不同劑量組減少了陰莖海綿體纖維化的程度，但結(jié)果不顯著的原因。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，為探索淫羊藿苷對于大鼠陰莖海綿體有無去纖維化的作用，可適當(dāng)延長飼喂淫羊藿苷的時(shí)間，在保證大鼠勃起功能不受衰老影響的前提下，進(jìn)一步說明淫羊藿苷對大鼠海綿體纖維化的作用。

綜上所述，雙側(cè)髂內(nèi)動(dòng)脈結(jié)扎能夠顯著破壞大鼠勃起功能；他達(dá)拉非灌胃和中劑量及高劑量淫羊藿苷灌胃能夠顯著改善血管性ED大鼠勃起功能；高劑量淫羊藿苷改善血管性ED大鼠勃起功能的效果，顯著優(yōu)于他達(dá)拉非改善血管性ED大鼠勃起功能的效果。模型組大鼠陰莖海綿體纖維組織面積顯著大于假手術(shù)組陰莖海綿體纖維組織面積，提示雙側(cè)髂內(nèi)動(dòng)脈結(jié)扎后，陰莖海綿體內(nèi)由于動(dòng)脈灌注不足，可以造成陰莖海綿體的纖維組織增加，對ED的發(fā)病過程提出新的解釋。他達(dá)拉非和各劑量淫羊藿苷的作用可以使得大鼠陰莖海綿體纖維面積不同程度下降，但效果不顯著。