秦 瑞，納 欽，曹 璐，劉俊寶，邊 帥，冷維春*

(1．吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 婦產(chǎn)科，吉林 長(zhǎng)春130033；2．內(nèi)蒙古科爾沁右翼中旗蒙醫(yī)醫(yī)院,內(nèi)蒙古 興安盟029400；3.科爾沁右翼中旗蒙醫(yī)研究所,內(nèi)蒙古 興安盟029400；4.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)·吉林省人參科學(xué)研究院，吉林 長(zhǎng)春130117)

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤，早期患者可以通過(guò)手術(shù)切除病灶獲得根治或延緩疾病的發(fā)展，晚期患者最常規(guī)的治療手段就是放療與化療[1-4]。然而，放化療對(duì)于一部分的晚期患者療效有限[5]。流行病學(xué)研究已充分明確，生殖器感染HPV與宮頸癌的發(fā)生和性行為存在聯(lián)系。若個(gè)人任一階段曾存在多個(gè)性伴侶，或性伴侶較多人員的伴侶，則感染 HPV 的風(fēng)險(xiǎn)更大[6-7]。自噬與一些生物功能和其他應(yīng)激反應(yīng)的整合是由承擔(dān)調(diào)節(jié)機(jī)制的轉(zhuǎn)錄因素決定的[8]。人參所含人參單體皂苷的種類在40種以上，提取自人參根內(nèi)的單體皂苷成分以Rb1、Rc等為主，在削弱腫瘤生長(zhǎng)，減弱腫瘤細(xì)胞侵襲性以及加速腫瘤細(xì)胞凋亡等方面，Rh2和Rg3發(fā)揮著關(guān)鍵作用[9-12]。本研究探討人參皂苷(Ginsenoside)影響宮頸癌HeLa細(xì)胞自噬與凋亡狀況，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

復(fù)蘇人類宮頸癌HeLa細(xì)胞(ATCC，CCL-2),待已融化，馬上添加適量(基本為等量)的DMEM[由10%FBS(胎牛血清)與青/鏈霉素(1%)制備]內(nèi)，先離心，再取出，將上清倒掉，添加適量的DMEM，再次反復(fù)吹打，然后全部轉(zhuǎn)移至已提前加入5 ml DMEM的T25細(xì)胞瓶中，將細(xì)胞瓶(內(nèi)含HeLa細(xì)胞)移至溫度、濕度皆恒定的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察，待瓶底細(xì)胞80%左右，開始傳代與鋪板。

1.2 主要儀器與試劑

1.3 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞存活率

將 HeLa 細(xì)胞用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗滌兩次，向96孔板內(nèi)接種細(xì)胞，各孔的接種量皆為2×103，第2 d，待細(xì)胞貼壁，將上清培養(yǎng)液清除掉，再添加培養(yǎng)基，完成DMSO對(duì)照組、人參皂苷Rh2、人參皂苷Rg3實(shí)驗(yàn)組的設(shè)置，這2組皆設(shè)置4個(gè)復(fù)孔，各孔體積皆為0.2 ml，經(jīng)過(guò)1 d培養(yǎng)，向各孔添加CCK-8 試劑，加量皆為0.02 ml，再移至培養(yǎng)箱(37 ℃)內(nèi)，進(jìn)行45 min遮光孵育，借助酶標(biāo)儀，測(cè)定各孔OD 450 nm值，同時(shí)對(duì)每組細(xì)胞存活率進(jìn)行計(jì)算。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

1.5 蛋白質(zhì)印跡分析

通過(guò)離心收集處理的細(xì)胞，重懸于裂解緩沖液中，煮沸15 min。用Bradford測(cè)定試劑盒測(cè)定總蛋白濃度。然后通過(guò)12%SDS-PAGE(每泳道8 μg)分離蛋白質(zhì)，然后將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。于室溫環(huán)境中，把膜浸于干脫脂牛奶(5%)內(nèi)，接受0.5 h的封閉處理。再通過(guò)PBST(PBS tween-20)實(shí)施洗滌，之后對(duì)膜和一抗(1∶1 000)于4℃溫度下實(shí)施12 h的孵育處理，再和二抗(1∶1 000)于室溫中實(shí)施60 min的孵育處理。 最后，通過(guò)化學(xué)發(fā)光底物將蛋白質(zhì)信號(hào)可視化，并使用Ibright成像系統(tǒng)進(jìn)行成像，使用ImageJ軟件進(jìn)行光密度分析。

1.6 吖啶橙(AO)染色法

向12孔板內(nèi)接種細(xì)胞，同時(shí)培養(yǎng)12 h，之后分別添加DMSO、Rh2、Rg3接著進(jìn)行1 d培養(yǎng)。通過(guò)PBS對(duì)細(xì)胞實(shí)施1遍洗滌處理，于室溫環(huán)境中，通過(guò)甲醛(4%)固定，計(jì)時(shí)10 min，通過(guò)PBS對(duì)細(xì)胞實(shí)施洗滌，添加AO染色液(0.01 mg/mL)，再進(jìn)行20 min的遮光孵育處理。然后用AO在黑暗中染色30 min，在488 nm的熒光顯微鏡下觀察并成像。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

全部數(shù)據(jù)為3次平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果，且由“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”描述。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用Repeated Measures ANOVA法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人參皂苷影響宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖狀況

如圖1所示(顯示部分皂苷)，在正常培養(yǎng)條件下，作用時(shí)間24 h，HeLa細(xì)胞Rb1、Rh2和Rg3的細(xì)胞毒性篩選發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rh2在濃度為45 μM和Rg3濃度為75 μM時(shí)，細(xì)胞活力顯著下降。

圖1 人參皂苷對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖的影響

2.2 人參皂苷對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡的影響

如圖2所示，與對(duì)照組相比較，宮頸癌HeLa細(xì)胞經(jīng)過(guò)Rh2和Rg3處理后的凋亡率分別為32.07%和27.13%，都顯著高于DMSO組的2.08%。經(jīng)由蛋白免疫印跡可知，對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞完成Rh2、Rg3干預(yù)，細(xì)胞內(nèi)Bax凋亡相關(guān)蛋白含量大幅增多，Bcl-2凋亡相關(guān)蛋白含量則大幅減少。

圖2 人參皂苷促進(jìn)宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡及相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá)

2.3 人參皂苷影響宮頸癌HeLa細(xì)胞自噬狀況

在人參皂苷處理后，許多AVOs以劑量依賴性方式出現(xiàn)。也就是當(dāng)自噬水平較低時(shí)，主要觀察到綠色熒光，當(dāng)自噬水平升高，則綠色熒光減弱，紅色熒光增強(qiáng)。如圖3所示，結(jié)果表明，人參皂苷Rh2和Rg3都能顯著提高宮頸癌細(xì)胞的自噬水平。

圖3 人參皂苷對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞自噬的影響

3 討論

自噬抑制屬于一類具創(chuàng)新性的細(xì)胞調(diào)控機(jī)制，自噬同腫瘤發(fā)展存在緊密聯(lián)系，對(duì)確定腫瘤新的治療靶點(diǎn)和尋找新的抗腫瘤藥物具有重要意義。中藥可否經(jīng)由調(diào)控腫瘤細(xì)胞的自噬途徑，實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤的有效抑制效果，為今后抗腫瘤研究的趨勢(shì)。

對(duì)于包括子宮頸癌在內(nèi)的多種癌癥，介入治療是一種副作用少、并發(fā)癥少的新療法。人參皂苷在癌癥[13-15]的預(yù)防和治療中發(fā)揮著重要作用?？赏ㄟ^(guò)介入治療與其他化療藥物聯(lián)合使用，避免口腔和腸道的降解。與口服相比，局部應(yīng)用可減少化療藥的用量[16-17]。

本研究通過(guò)篩選多種人參皂苷，證實(shí)Rh2以及Rg3皆可以顯著削弱宮頸癌細(xì)胞的增殖，使細(xì)胞活力降低，并且促進(jìn)細(xì)胞凋亡，同時(shí)提高了宮頸癌細(xì)胞的凋亡蛋白表達(dá)水平。總之，Rh2與Rg3這兩種人參皂苷可對(duì)細(xì)胞增殖施以有效抑制，對(duì)其凋亡進(jìn)行促進(jìn)，期間可將細(xì)胞自噬激活。而人參皂苷對(duì)宮頸癌細(xì)胞的凋亡同自噬間的聯(lián)系與確切機(jī)制依然有待開展深入的研究和探索。