楊 雨，劉定坤，李凌峰，隋 欣，王碧舟，劉志輝

(吉林大學(xué)口腔醫(yī)院，吉林 長春130021)

口腔癌是頭頸部較常見的惡性腫瘤之一，術(shù)后放療為減少復(fù)發(fā)的主要手段，患者在放療時(shí)除了殺傷腫瘤細(xì)胞外，對周圍組織也有不同程度的損傷[1]。大量臨床報(bào)告顯示，惡性腫瘤術(shù)后并行放療的患者通常會出現(xiàn)放射損傷復(fù)合皮膚損傷，是一種典型的“放創(chuàng)復(fù)合傷”(Combined radiation and wound injury,CRWI)[2]，這類創(chuàng)口遷延難愈。以往有研究[2-3]報(bào)道干細(xì)胞療法可以改善輻射損傷對皮膚組織的不良影響，促進(jìn)組織愈合。瘦素(Leptin)是一種多效的細(xì)胞因子，近年來的研究[4-5]顯示，Leptin在傷口愈合中也發(fā)揮著重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)[6]，表達(dá)外源性Leptin基因的HPMSCs能顯著提高CRWI皮瓣的成活率，提示干細(xì)胞療法結(jié)合基因療法在CRWI傷口愈合中具有的潛在的研究及應(yīng)用價(jià)值，但轉(zhuǎn)染Leptin的HPMSCs對放射后皮膚或粘膜修復(fù)細(xì)胞的作用尚不明確。本研究基于本課題組之前的研究結(jié)果，通過建立口腔牙齦黏膜修復(fù)細(xì)胞放創(chuàng)復(fù)合傷體外模型，進(jìn)一步研究HPMSCs/Leptin對牙齦黏膜修復(fù)細(xì)胞的趨化能力、增殖能力以及炎癥因子分泌水平的影響，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、試劑和設(shè)備人口腔角質(zhì)細(xì)胞HOK 2610、人牙齦成纖維細(xì)胞HGnF 2620和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC 8000(廣州基尼歐生物科技有限公司)，轉(zhuǎn)染空白慢病毒載體的人胎盤源間充質(zhì)干細(xì)胞HPMSCs/NC和轉(zhuǎn)染Leptin慢病毒載體的人胎盤源間充質(zhì)干細(xì)胞HPMSCs/Leptin由本課題組前期實(shí)驗(yàn)留存，DMEM(Gibco，12800-017)，血清、胰酶(Gibco，25200-056)，Transwell侵襲小室(BD Biocoat，354480)，ELISA試劑盒：Human GM-CSF、IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α ELISA KIT(欣博盛，EHC103a)，CKK-8試劑盒(碧云天，C0042)，二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo，3111)，激光共聚焦顯微鏡(NIKON，C2)，輻照儀(Faxitron，MultiRad225)，研究級倒置顯微鏡(mshOt，MF51)，酶標(biāo)儀(BioTek，ELX800)。

1.2 方法

1.2.1實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為HPMSCs/NC組[對照組，L.v.-pEB-copGFP(T2A) PURO]和HPMSCs/leptin組[實(shí)驗(yàn)組，L.v.-pEB-copGFP(T2A) PURO-leptin]，HPMSCs/NC和HPMSCs/leptin均培養(yǎng)于含10%血清、1%雙抗的DMEM-LG培養(yǎng)基中，置于CO2孵箱中培養(yǎng)(培養(yǎng)條件為5%CO2、飽和濕度、37℃)。

1.2.2輻照處理與Transwell檢測 復(fù)蘇HOK、HGnF和HUVEC細(xì)胞加入到含10%血清、1%雙抗的DMEM-LG培養(yǎng)基中，置于CO2孵箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度均達(dá)到90%時(shí)，進(jìn)行單次X射線輻射，劑量20GY。選擇8.0 μm PET膜的Transwell系統(tǒng)，使用無血清的DMEM重懸輻照后的HOK、HGnF和HUVEC，各取100 μl(約含細(xì)胞1×105個(gè))加入Transwell的小室上室，在下室加入1×104個(gè)HPMSCs/NC或HPMSCs/leptin細(xì)胞，孵育48 h后棄去上室細(xì)胞，4%多聚甲醛固定膜下表面的細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，倒置熒光顯微鏡下觀察拍照，隨機(jī)選擇圖片并計(jì)數(shù)。

1.2.3構(gòu)建共培養(yǎng)體系 選擇0.4 μm PET膜的Transwell系統(tǒng)，取輻照后的HOK、HGnF和HUVEC細(xì)胞懸液400 μl(含細(xì)胞1×105個(gè))分別加入上室，下室加入HPMSCs/Leptin或HPMSCs/NC各200 μl(含細(xì)胞1×104個(gè))，置于CO2孵箱中培養(yǎng)。構(gòu)建6組共培養(yǎng)體系即實(shí)驗(yàn)組：HGnF+HPMSCs/Leptin、HOK+HPMSCs/Leptin、HUVEC+HPMSCs/Leptin；對照組：HGnF+HPMSCs/NC、HOK+HPMSCs/NC、HUVEC+ HPMSCs/NC。

1.2.4細(xì)胞增殖活性檢測 于1、2、3、4 d分別收集上述6組共培養(yǎng)體系中輻照后的HOK、HGnF和HUVEC細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2.0×104個(gè)/ml，按100 μl/孔(即2.0×103個(gè)細(xì)胞)接種于96孔板，置于CO2孵箱中培養(yǎng)24 h。每孔加入10 μl CCK-8檢測液，置于孵箱培養(yǎng)2 h，使用酶標(biāo)儀測定450 nm處的光密度值即OD450。

1.2.5ELISA檢測 收集各組(HGnF+HPMSCs/Leptin、HGnF+HPMSCs/NC、HOK+HPMSCs/Leptin、HUVEC+HPMSCs/Leptin、HOK+HPMSCs/NC、HUVEC+HPMSCs/NC)培養(yǎng)基，使用合適的ELISA試劑盒檢測人GM-CSF、IL-1、IL-6和IL-8，使用酶標(biāo)儀測定OD450值。所有ELISA檢測均嚴(yán)格按照各試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用IBM SPSS Statistics 22進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，GraphPad Prism 7數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示。各組采用單因素方差分析，并輔以Bonferroni校正。實(shí)驗(yàn)組與對照組間比較使用t檢驗(yàn)，以P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Transwell檢測結(jié)果

HPMSCs/NC和HPMSCs/Leptin對輻照后的HGnF、HOK和HUVEC均有不同程度的趨化性(如圖1)，相比于HPMSCs/NC組，將HPMSCs/Leptin組置于Transwell模型下室時(shí)，能使更多的HUVEC遷移到下室，表明HPMSCs/Leptin能促進(jìn)HUVEC的遷移，推測HPMSCs/Leptin對HUVEC的趨向性增強(qiáng)；但相比于HPMSCs/Leptin組，將HPMSCs/NC組置于Transwell模型下室時(shí)，能使更多的HGnF和HOK遷移到下室，表明HPMSCs/Leptin抑制HGnF和HOK的遷移，推測HPMSCs/Leptin對HGnF和HOK的趨向性減弱。

圖1 Transwell檢測結(jié)果

左圖為各混合培養(yǎng)體系中HPMSCs/NC或HPMSCs/Leptin誘導(dǎo)進(jìn)入下室的輻照后的HGnF、HOK和HPMSCs細(xì)胞結(jié)晶紫染色結(jié)果。右圖為進(jìn)入下室的細(xì)胞數(shù)(*：0.01

2.2 細(xì)胞活性的CCK-8檢測結(jié)果

如圖2A所示， HGnF+HPMSCs/Leptin混合培養(yǎng)體系的OD450值與HGnF+HPMSCs/NC混合培養(yǎng)體系的OD450值無顯著性差異(P>0.05)，表明HPMSCs/Leptin對輻照損傷后的HGnF的增殖能力影響不大。圖2B顯示，HOK+HPMSCs/Leptin混合培養(yǎng)體系的OD450值顯著高于HOK+HPMSCs/NC混合培養(yǎng)體系的OD450值(0.001

圖2 各混合培養(yǎng)體系中輻照后的HGnF、HOK和HUVEC細(xì)胞增殖活性CCK -8檢測結(jié)果

2.3 ELISA檢測結(jié)果

如圖3所示，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測定輻照損傷后24 h、48 h和72 h各混合培養(yǎng)體系中分泌的炎性細(xì)胞因子濃度。與對照混合培養(yǎng)體系(HGnF+HPMSCs/NC、HOK+HPMSCs/NC)相比，實(shí)驗(yàn)混合培養(yǎng)體系(HGnF+HPMSCs/Leptin、HOK+HPMSCs/Leptin、)培養(yǎng)基上清液中人IL-1α、GM-CSF和TNF-α在各時(shí)間段(輻照后24 h、48 h和72 h)的分泌量顯著高于對照混合培養(yǎng)體系(P<0.05)。在輻照損傷后72 h，檢測各混合培養(yǎng)體系培養(yǎng)基上清液中人IL-6的分泌量，HOK+HPMSCs/NC和HOK+HPMSCs/Leptin間無顯著性差異(P>0.05)，混合培養(yǎng)體系HGnF+HPMSCs/Leptin顯著高于其對照混合培養(yǎng)體系HGnF+HPMSCs/NC(P<0.001)。

圖3 ELISA檢測各混合培養(yǎng)體系中輻照后的HGnF、HOK和HUVEC表達(dá)炎性因子(IL-1α、IL-6、GM-CSF、TNF-α)水平

此外，各混合培養(yǎng)體系中人IL-1β和IL-8的分泌量太少而未能檢測出。綜上，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HPMSCs/Leptin能促進(jìn)HGnF、HOK分泌炎癥因子人IL-1α、IL-6、GM-CSF和TNF-α。

3 討論

口腔牙齦黏膜的主要修復(fù)細(xì)胞包括角質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞。輻照損傷后，傷口修復(fù)細(xì)胞數(shù)量減少或功能障礙導(dǎo)致生長因子和膠原合成減少[7]，傷口局部的血管在受到放射損傷后也會因管壁水腫而發(fā)生血管阻滯和封閉[8]，導(dǎo)致傷口局部細(xì)胞因子缺乏和相關(guān)細(xì)胞趨化障礙。這些生理現(xiàn)象都阻礙了傷口的正常愈合過程，造成了傷口的遷延不愈。

本研究通過建立口腔牙齦黏膜修復(fù)細(xì)胞放創(chuàng)復(fù)合傷體外模型，結(jié)果證實(shí)表達(dá)外源性Leptin的人胎盤源間充質(zhì)干細(xì)胞HPMSCs/Leptin能明顯促進(jìn)HUVEC遷移，從而招募更多HUVEC到達(dá)傷口床及傷口邊緣以促進(jìn)血管形成，進(jìn)而促進(jìn)傷口愈合。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)相比于對照組，HPMSCs/Leptin組對輻照后HGnF或HOK細(xì)胞趨向性減弱，而Tadokoro等[5]的研究則認(rèn)為，局部注射Leptin后，其可促進(jìn)表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖、分化和遷移從而促進(jìn)皮膚傷口愈合，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相悖，原因可能是由于細(xì)胞種類不同，或與口腔黏膜角質(zhì)細(xì)胞的特性有關(guān)，然而目前尚無有利證據(jù)解釋這一差異，希望在今后的研究中進(jìn)一步探討。此外，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染空白慢病毒載體的人胎盤源間充質(zhì)干細(xì)胞(HPMSCs/NC組)對輻照損傷后的3種口腔牙齦黏膜修復(fù)細(xì)胞均有一定的趨向性，證實(shí)HPMSCs本身也能在一定程度上促進(jìn)口腔牙齦黏膜修復(fù)細(xì)胞的遷移。

輻照損傷后修復(fù)細(xì)胞數(shù)量的減少可能是由于細(xì)胞凋亡增加或細(xì)胞增殖受抑，亦或是兩者共同作用的結(jié)果。李培兵等[9]發(fā)現(xiàn)，Leptin可促進(jìn)大鼠成纖維細(xì)胞的增殖。也有研究[5]認(rèn)為Leptin可促進(jìn)傷口處角質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力，為角質(zhì)細(xì)胞覆蓋創(chuàng)面和內(nèi)皮細(xì)胞成血管化奠定物質(zhì)基礎(chǔ)，進(jìn)而促進(jìn)傷口愈合。本研究建立了HPMSCs/Leptin與3種口腔牙齦黏膜修復(fù)細(xì)胞混合培養(yǎng)體系，CCK-8結(jié)果顯示，HPMSCs/Leptin能促進(jìn)輻照損傷后的HUVEC和HOK的增殖，而對輻照后HGnF的增殖能力未見顯著增強(qiáng)。這一結(jié)果與李培兵等[9]研究結(jié)果不同，差異可能與成纖維細(xì)胞的種屬不同有關(guān)，該問題將在今后的研究中進(jìn)一步探討。

相較于一般傷口，放創(chuàng)復(fù)合傷傷口難愈合的原因之一就是傷口局部的血管在受到放射損傷后會因管壁水腫而發(fā)生阻滯和封閉[8]，導(dǎo)致到達(dá)傷口局部的細(xì)胞因子缺乏。細(xì)胞因子是一類小分子活性多肽，對細(xì)胞的生長、分化具有顯著的調(diào)控作用，并在細(xì)胞趨化、細(xì)胞增殖、血管新生、膠原合成和基質(zhì)成熟等傷口愈合過程中發(fā)揮著重要的作用。白細(xì)胞介素-1(interleukin-1，IL-1)在宿主抵御感染、炎癥、損傷和應(yīng)激等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[10]。IL-1包括白細(xì)胞介素-1α(IL-1α)和白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)兩種亞型，其在角質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中均有表達(dá)。IL-1α能與IL-1R結(jié)合并激活細(xì)胞[11]。IL-1β是一種可誘導(dǎo)的細(xì)胞因子，在正常細(xì)胞或組織中不表達(dá)，受到刺激后才表達(dá)。Lierova1等[12]研究發(fā)現(xiàn)，電離輻射損傷肺上皮后可導(dǎo)致IL-1α從應(yīng)激和/或壞死的細(xì)胞中釋放到達(dá)細(xì)胞外間隙。本研究發(fā)現(xiàn)，HPMSCs/Leptin能促進(jìn)HGnF、HOK和HUVEC分泌炎癥因子人IL-1α，而對人IL-1β的分泌無明顯影響，推測HPMSCs/Leptin促進(jìn)輻照損傷后的修復(fù)細(xì)胞分泌更多的IL-1α，促進(jìn)炎癥反應(yīng)，而IL-1β相對低水平的分泌量調(diào)控了炎癥反應(yīng)的進(jìn)程，防止過度炎癥反應(yīng)對機(jī)體的損傷，可能是一種保護(hù)性機(jī)制。

白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)是一種多功能的多效細(xì)胞因子[13]，在傷口愈合中主要起促進(jìn)炎癥反應(yīng)的作用。放射性肺炎患者血液標(biāo)本中IL-6水平顯著升高，IL-1α水平的增高與IL-6呈正相關(guān)關(guān)系[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，HPMSCs/Leptin能促進(jìn)HGnF、HOK和HUVEC分泌炎癥因子人IL-6，推測HPMSCs/Leptin可促進(jìn)輻照損傷后的修復(fù)細(xì)胞分泌更多的IL-6，協(xié)同增加的IL-1α水平，促進(jìn)炎癥反應(yīng)。

白細(xì)胞介素-8(IL-8)，又稱趨化因子-8(CXCL-8)，其不僅是一種炎癥介質(zhì)，還作為一種趨化因子，可吸引血管中的炎細(xì)胞(尤其中性粒細(xì)胞)到達(dá)局部組織參與炎癥反應(yīng)。此外，IL-8可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，使具有血管生成活性[12]，還可通過引起局灶性粘附的喪失而趨化成纖維細(xì)胞。本研究發(fā)現(xiàn)，各組輻照后細(xì)胞的IL-8表達(dá)水平低下，表明HPMSCs/Leptin在傷口愈合過程中的作用可能與IL-8無關(guān)。

粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞-集落刺激因子(GM-CSF)屬于糖蛋白分子家族，具有多重生物活性。有研究文獻(xiàn)報(bào)道[15]在傷口愈合的組織增殖期，GM-CSF能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞的趨化、增殖和分化，加速血管新生、促進(jìn)肉芽組織形成、創(chuàng)面收縮[16]和再上皮化，從而發(fā)揮促進(jìn)傷口愈合作用。本研究發(fā)現(xiàn)，HPMSCs/Leptin組3種輻照后細(xì)胞GM-CSF的表達(dá)水平均被上調(diào)，認(rèn)為HPMSCs/Leptin有利于GM-CSF的表達(dá)進(jìn)而發(fā)揮促進(jìn)傷口愈合的作用。

腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是一種由單核-巨噬細(xì)胞分泌的促炎細(xì)胞因子，能局限組織損害和促進(jìn)創(chuàng)傷組織的修復(fù)與改建[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，HPMSCs/Leptin組可提高輻照后HGnF、HOK和HUVEC 3種細(xì)胞表達(dá)TNF-α的水平，認(rèn)為HPMSCs/Leptin可通過促進(jìn)TNF-α的表達(dá)對傷口愈合起到積極作用。

此外，本課題組前期實(shí)驗(yàn)表明[6]，在放創(chuàng)復(fù)合傷大鼠模型中，轉(zhuǎn)染Leptin的HPMSCs能增加皮瓣內(nèi)皮細(xì)胞特異性因子的表達(dá)和新生血管的數(shù)量，促進(jìn)放創(chuàng)復(fù)合傷皮瓣的愈合。

綜上， HPMSCs/Leptin對輻照后HGnF、HOK和HUVEC這3種口腔牙齦黏膜修復(fù)細(xì)胞的遷移、增殖、表達(dá)炎癥因子水平均有不同程度的影響，猜測HPMSCs/Leptin可通過補(bǔ)充修復(fù)細(xì)胞、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、促進(jìn)血管新生等途徑發(fā)揮促進(jìn)傷口愈合的作用，然而，其內(nèi)在相互作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步探索和驗(yàn)證。此外，在放創(chuàng)復(fù)合傷愈合過程中，轉(zhuǎn)染Leptin的HPMSCs與口腔牙齦黏膜修復(fù)細(xì)胞之間其它可能的相互作用、作用途徑和機(jī)制仍有待進(jìn)一步探索。