楊 帆,韓 瑜,聶婷婷,劉玲玲,于江虹,焦立新,陳 琳

(吉林省血液中心，吉林 長春130033)

Rh血型系統(tǒng)中，D抗原免疫原性最強，大多數(shù)的Rh陰性個體，通過輸血或妊娠，可受D抗原陽性紅細胞免疫而產(chǎn)生抗D。Rh血型D抗原(RhD)陰性女性懷孕時胎兒會面臨新生兒溶血病風(fēng)險，所以常進行抗體篩查檢測和抗D免疫球蛋白注射。但最新研究表明：中國RhD初篩陰性人群中，約17%-30%為“亞洲型”DEL血型，其分子遺傳背景為RHD*1227A基因型，該血型紅細胞表面表達完整的RhD抗原，懷孕婦女在RhD陽性胎兒的免疫刺激下不產(chǎn)生抗D，因此不需進行過于頻密的抗體篩查檢測和抗D免疫球蛋白注射?？墒荄EL血型檢測并未常規(guī)應(yīng)用于臨床，造成該血型孕婦長期被作為RhD陰性對待。本研究通過對傳統(tǒng)血型血清法(吸收放散法)與分子生物學(xué)法(熒光PCR法、PCR-SSP法和熔解曲線分析法)對“亞洲型”DEL血型檢測，對RHD*1227A基因型檢出率進行比較及一致性分析，為實驗室及臨床提供合理選擇“亞洲型”血型檢測方法提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源本血液中心357例經(jīng)鑒定為RhD陰性的獻血者血液標(biāo)本，經(jīng)過對DEL血型高度關(guān)聯(lián)的C抗原[1]篩選，90例陽性標(biāo)本用于檢測“亞洲型”DEL血型。

1.2 儀器與試劑快速自動編程PCR儀(BIO-RAD)、熒光定量PCR 儀(ABI 7500，美國)、單克隆抗體IgG抗-D(上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司)、單克隆抗體IgG+IgM(加拿大，IMMUCOR)、IgG+IgM(英國，MILLIPORE)；微柱凝膠抗人球卡(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)、樣本釋放劑試劑盒(廣州展全生物科技有限公司)、DNA提取試劑盒(康為世紀(jì))、紅細胞RHD基因分型檢測試劑盒(江蘇偉禾生物科技有限公司)。

1.3 檢測方法

1.3.1血型血清學(xué)試驗 待確認紅細胞洗滌3遍后配制成濃度為0.8%-1%的紅細胞懸液加入微柱凝膠抗人球卡3孔，分別加入3種抗-D試劑(單克隆IgG及IgM+IgG)，37℃孵育15 min后離心。對應(yīng)血漿加入抗篩細胞，采用凝膠卡法進行抗體篩查。確認RhD陰性的紅細胞1滴加入試劑抗-C，結(jié)果為陽性的樣本進行下一步“亞洲型”DEL血型檢測。

1.3.2DNA提取 嚴(yán)格按照DNA提取試劑盒說明書步驟操作，濃度介于15-40 ng/μl，A260/A280介于1.6-2.0之間。

1.3.3吸收放散法 參照文獻報道[2]及試劑盒說明書步驟及方法進行。

1.3.4熒光PCR法 按照人類紅細胞RHD基因分型檢測試劑盒說明書步驟操作及結(jié)果分析判讀。熒光PCR擴增檢測條件：95℃ 2 min 30 s；94℃ 15 s、65℃(信號采集點)55 s，35個循環(huán)。

1.3.5PCR-SSP法 文獻報道[3]針對中國漢族人群最常見“亞洲型”DEL血型等位基因RHD*01EL.01(即RHD*1227A基因型)引物序列，同時使用陰、陽對照進行PCR-SSP試驗。PCR擴增條件：94℃預(yù)變性5 min,接著94℃30 s,62℃30 s，72℃15 s，35次，72℃5 min之后，4℃退火延伸。

1.3.6熔解曲線分析法 按照文獻報道[4]對標(biāo)本進行熔解曲線分析,反應(yīng)程序為:95℃ 15 s;60℃ 1 min，以0.2℃/s 的升溫速度升溫至95℃，收集此溫度范圍內(nèi)的熒光信號。熔解曲線分析程序結(jié)束后，自動生成1個熔解曲線。結(jié)果使用ABI 7500系統(tǒng)自帶的溶解曲線分析程序進行分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

用Excel 2017進行數(shù)據(jù)整理，應(yīng)用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。不同方法檢出率的比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Kappa值在0.41-0.60為中度的一致性；Kappa值在0.61-0.80為高度一致性。

2 結(jié)果

2.1 4種檢測方法檢出率比較

見表1。

表1 4種檢測方法檢出率比較

組間比較，χ2值為1.275，P>0.05結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)意義

2.2 4種檢測方法一致性比較

見圖1。

圖1 4種檢測方法一致性比較

3 討論

DEL表型在20世紀(jì)80年代發(fā)現(xiàn)于東亞，是一種具有很微弱D抗原的血型[5]。中國人群中超過95%的DEL血型個體的分子遺傳背景為RHD*01EL.01等位基因(即RHD*1227A)。以往常用傳統(tǒng)血型血清學(xué)的吸收放散法進行檢測，但是操作復(fù)雜且周期長，隨著分子生物學(xué)法發(fā)展，有文獻報道采用PCR-SSP法和熔解曲線分析法檢測DEL血型[3-4]，新近又出現(xiàn)了熒光PCR法。本研究對這幾種檢測方法進行比較，并分析操作的影響因素。統(tǒng)計結(jié)果表明4種檢測方法結(jié)果檢出率(P>0.05)無顯著性差異,傳統(tǒng)吸收放散法檢出率最高，但是經(jīng)過后續(xù)分子生物學(xué)實驗發(fā)現(xiàn)存在個別假陽性情況。與吸收放散法比較，檢測結(jié)果一致性從高到低分別為熒光PCR法、熔解曲線分析法、PCR-SSP法。

經(jīng)過對比我們總結(jié)如下：吸收放散法優(yōu)點是試劑價格便宜，需要設(shè)備簡單，適合基層單位開展，但是操作過程中要掌握好細節(jié)提高準(zhǔn)確性，細胞要多次洗滌徹底，酸放散過程需嚴(yán)格把控反應(yīng)時間及離心時間，注意中和顯色度，避免中和時間過長，影響結(jié)果；熒光PCR法優(yōu)點是特異性好，結(jié)果好判定且耗時短，但是試劑費用大，實驗中需注意保證反應(yīng)板及蓋板膜的潔凈，以免造成熒光污染；熔解曲線分析法優(yōu)點是價格低，實驗人員要有一定分子生物學(xué)經(jīng)驗，判讀結(jié)果時，按照Tm值(熔解溫度)區(qū)分不同等位基因。PCR-SSP法由于成本低及操作便利得到廣泛應(yīng)用，但是由于人員操作、試劑質(zhì)量、設(shè)備狀態(tài)等原因容易出現(xiàn)非特異性條帶或擴增失敗，導(dǎo)致假陰性或假陽性，影響結(jié)果判讀。

綜上所述，通過幾種“亞洲型”DEL血型檢測方法的比較分析，了解各自優(yōu)缺點，實驗室可以根據(jù)自身條件選擇準(zhǔn)確、合理的檢測方案。