席 杰，梁 辰，鄧子輝，馮 杰，薛 輝，師丹丹，高艷紅，顏光濤*

電化學(xué)發(fā)光免疫分析是一種先進(jìn)的免疫檢測(cè)方法，其結(jié)合了免疫檢測(cè)和電化學(xué)發(fā)光技術(shù)[1]，具有靈敏度高，特異性強(qiáng)，穩(wěn)定性好，反應(yīng)速度快，標(biāo)本用量少等特點(diǎn)[2-3]。電化學(xué)發(fā)光免疫分析因自動(dòng)化程度高、線性范圍廣等特點(diǎn)在臨床應(yīng)用廣泛，其主要用于病毒、激素和腫瘤標(biāo)記物的檢測(cè)等，可以快速準(zhǔn)確的檢測(cè)臨床標(biāo)本，為疾病的篩查和鑒定提供依據(jù)。FT4能夠準(zhǔn)確地反應(yīng)甲狀腺的功能，其在甲亢、甲減等發(fā)病的過(guò)程中都起到重要的作用,是甲狀腺功能一個(gè)靈敏的指標(biāo)[4]。本文采用競(jìng)爭(zhēng)法一步法的原理檢測(cè)人血清中FT4濃度，將樣本和生物素標(biāo)記的FT4抗原，競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記的抗體，形成的免疫復(fù)合物與鏈霉親和素包裹的磁珠形抗原抗體復(fù)合物，通過(guò)磁場(chǎng)洗滌將未結(jié)合物沖洗除去，從而檢測(cè)出待測(cè)樣品中的FT4濃度。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器和材料

1.1.1主要儀器 cobas e601全自動(dòng)電化學(xué)分析儀：Roche Diagnostics GmbH；eCL 8000全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光測(cè)定儀：深圳普門(mén)公司。

1.1.2主要試劑 FT4抗體、生物素化的FT4均購(gòu)于深圳君領(lǐng)生物科技有限公司；自Sigma公司采購(gòu)生物素；自上海海肽生物科技有限公司采購(gòu)抗原；自Thermo Fisher采購(gòu)鏈霉親和素磁顆粒；由深圳普門(mén)公司合成三聯(lián)吡啶釕；由Equitech-Bio公司提供牛血清白蛋白(BSA)；其他的試劑均為分析純。

1.1.3標(biāo)本來(lái)源 分別收集解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心的294例健康體檢者的血清和 72例甲功異?；颊叩难?。健康體檢患者入選標(biāo)準(zhǔn)：①血液指標(biāo)正常:血、尿常規(guī)及生化腫瘤項(xiàng)目等指標(biāo)正常;②無(wú)高血壓、糖尿病、心腦血管疾病等重大疾病;③近期無(wú)輸血和手術(shù)史。健康體檢患者血清樣本排除標(biāo)準(zhǔn)：①溶血標(biāo)本;②黃疸樣本;③乳糜標(biāo)本;④標(biāo)本放置時(shí)間過(guò)久。

1.2 操作方法的建立

1.2.1質(zhì)控品和校準(zhǔn)品的制備 用牛血清白蛋白和Buffer(含有0.05% Proclin300，經(jīng)0.22 μm的濾膜過(guò)濾)稀釋FT4抗原(上海海肽生物科技有限公司)純品，并且放在2-8℃長(zhǎng)期保存。校準(zhǔn)品可溯源到Roche Elecsys FT4。

1.2.2磁珠的制備 將鏈霉親和素包被的磁珠用PBS稀釋?zhuān){(diào)整濃度到0.75 mg/mL，放于2-8℃避光保存。

1.2.3標(biāo)記抗體的制備 加入一定體積的25 mM EPPS(pH7.4)將FT4單克隆抗體調(diào)整為1.0 μg/ml的濃度；該抗體與三聯(lián)吡啶釕和生物素分別按1∶20和1∶10 mol比例混合，在CB(0.05 M、 pH9.5)環(huán)境下，于室溫反應(yīng)0.5-1.5 h；經(jīng)過(guò)3次透析純化后，可除去未交聯(lián)的小分子樣物質(zhì)；隨即加等體積的甘油，放在2-8℃保存。

1.2.4實(shí)驗(yàn)方法 本方法采用競(jìng)爭(zhēng)法一步法模式進(jìn)行檢測(cè)，將樣本和生物素標(biāo)記FT4抗原競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記的抗體，37℃孵育9 min后，形成了抗體-抗原復(fù)合體。該復(fù)合物與鏈霉親和素包被的磁微粒通過(guò)生物素，37℃孵育9 min，形成鏈霉親和素磁顆粒-生物素抗原-釕抗體復(fù)合物，經(jīng)過(guò)磁場(chǎng)的洗滌，可以將未結(jié)合的物質(zhì)沖洗除去；隨即在三丙胺激發(fā)緩沖液的環(huán)境下，檢測(cè)RLU。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的相對(duì)光子強(qiáng)度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，而后檢測(cè)出待測(cè)標(biāo)本中的FT4含量。

1.2.5試劑盒優(yōu)化 根據(jù)反應(yīng)體系如何選擇標(biāo)本的加樣量、抗原基質(zhì)、反應(yīng)體系稀釋液和抗體工作液濃度以對(duì)反應(yīng)體系來(lái)進(jìn)行優(yōu)化。

1.3 方法學(xué)評(píng)價(jià)

1.3.1靈敏度 將校準(zhǔn)品基質(zhì)(馬血清)重復(fù)測(cè)定20次，計(jì)算出RLU的平均值(M)和標(biāo)準(zhǔn)差(s)，可以得出M-2s。將 M-2s所對(duì)應(yīng)的相對(duì)光強(qiáng)代入定標(biāo)曲線中，求出對(duì)應(yīng)的濃度值，即靈敏度。

1.3.2準(zhǔn)確度 測(cè)定不同濃度FT4添加物樣本，其準(zhǔn)確度應(yīng)在90%-110%之間。

1.3.3精密度 a批內(nèi)精密度：分別重復(fù)檢測(cè)20次以下濃度水平的樣本：(18±3)pmol/L和(37±5)pmol/L，并算出測(cè)量結(jié)果的M和s。變異系數(shù)(CV)即s與M之比。b批間精密度:分別用3個(gè)批號(hào)的試劑檢測(cè)以下濃度水平的樣本：(18±3)pmol/L和(37±5)pmol/L，每個(gè)試劑盒重復(fù)檢測(cè)10次，算出30次測(cè)量結(jié)果的M和s并計(jì)算CV。

1.3.4線性 將線性范圍上限和下限附近的樣本進(jìn)行混合，分別按以下比例(1∶0、1∶0.25、1∶1、0.25∶1、0∶1)稀釋成5種不同的濃度，并分別重復(fù)測(cè)定3次，計(jì)算各個(gè)樣本的平均值，同時(shí)根據(jù)稀釋比例算出各個(gè)樣本的理論值，將得出的理論值和實(shí)測(cè)值回歸分析，得出相關(guān)系數(shù)r。

1.3.5熱穩(wěn)定性 將試劑盒在37℃分別放于0、2、4、6、8天后，和放于4℃的試劑盒比較，進(jìn)行性能評(píng)估。

1.3.6方法學(xué)比對(duì) 同時(shí)使用本方法的試劑盒和羅氏公司的FT4檢測(cè)試劑盒(電化學(xué)發(fā)光法)，分別測(cè)定44例血清中的FT4濃度，從而算出相關(guān)系數(shù)。

1.3.7參考范圍建立 通過(guò)檢測(cè)294例(男性150例，女性144例)健康人群的血清標(biāo)本，檢測(cè)指標(biāo)為血清FT4,計(jì)算出血清FT4均值和標(biāo)準(zhǔn)差，從而得出樣本95%參考范圍。

2 結(jié)果

2.1 校準(zhǔn)品和質(zhì)控品的濃度

低值和高值的校準(zhǔn)品濃度分別為：(10±1) pmol/L、(42.5±2.5) pmol/L。低值和高值的質(zhì)控品濃度分別為(25±4) pmol/L、(50±5) pmol/L。

2.2 試劑盒的優(yōu)化

2.2.1選擇標(biāo)本加樣量

分別取10、15、30、45、60 μl的標(biāo)本進(jìn)行加樣，并且檢測(cè)C0及C1水平，根據(jù)信噪比數(shù)值，選擇了樣本用量為15 μl(圖1)。

圖1 標(biāo)本用量與信噪比的關(guān)系

2.2.2選擇抗原基質(zhì)

分別篩選馬血清、新生牛血清、PBS-BSA(牛血清白蛋白+Buffer)、小牛血清、山羊血清等幾種常見(jiàn)抗原稀釋液。根據(jù)測(cè)定到的C0和C1時(shí)的信噪比與發(fā)光值水平，將牛血清白蛋白+Buffer作為FT4的抗原稀釋液。

2.2.3選擇反應(yīng)體系稀釋液

分別篩選多種不同pH值的緩沖液：0.1M PBS緩沖液(pH=6.4、7.4、8.4)、25 mM MES緩沖液(pH=6.0)、25 mM EPPS緩沖液(pH=7.4)等。根據(jù)檢測(cè)到的C0和C1時(shí)的信噪比與發(fā)光值水平，決定0.1M pH7.4的PBS緩沖液為最終選擇的緩沖液。

2.2.4選擇抗體工作液濃度

將生物素標(biāo)記抗體配制工作濃度分別為0.5、1.0、1.5 ng/mL、和三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗體的工作濃度分別是75 ng/mL、100 ng/mL、150 ng/mL，采用正交實(shí)驗(yàn)，根據(jù)信噪比比值，選擇生物素和三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記抗體的工作濃度分別為：1.0 ng/mL和100 ng/mL。

2.3 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.3.1靈敏度靈敏度為不大于0.30 pmol/L。

2.3.2準(zhǔn)確度

測(cè)定不同濃度FT4添加物樣本，其準(zhǔn)確度應(yīng)在90%-110%之間。

2.3.3精密度

該方法的批內(nèi)變異小于10%，批間變異小于15%(表1)。

表1 標(biāo)本批內(nèi)變異和批間變異的結(jié)果

2.3.4線性

在0.30-100 pmol/L范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)(r)高于0.9900，由此說(shuō)明在此范圍內(nèi)相關(guān)性良好(圖2)。

圖2 FT4線性

2.3.5熱穩(wěn)定性

將試劑在37℃分別放置0、2、4、6、8天后，檢測(cè)各項(xiàng)性能指標(biāo)，結(jié)果顯示檢測(cè)結(jié)果均達(dá)標(biāo)(表2)。

表2 熱穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果

2.3.6方法學(xué)比對(duì)

將44例血清標(biāo)本中的FT4濃度分別用羅氏公司和本方法中的FT4檢測(cè)試劑盒測(cè)定，其相關(guān)方程為Y=1.0039X-0.7512，相關(guān)系數(shù)為r=0.9899，見(jiàn)圖3。根據(jù)偏倚圖得知，測(cè)定值之間的差異呈隨機(jī)化，見(jiàn)圖4。

圖3 FT4標(biāo)本比對(duì)相關(guān)性

圖4 FT4標(biāo)本比對(duì)偏倚圖(相對(duì))

2.3.7正常參考范圍的建立

通過(guò)檢測(cè)294例(男性150例，女性144例)健康人群血清標(biāo)本，得出的參考范圍為：10.51-22.7 pmol/L。

3 討論

甲狀腺疾病是一種常見(jiàn)的內(nèi)分泌疾病，而甲狀腺激素水平的變化在甲狀腺疾病的診斷與治療中發(fā)揮了重要作用。FT4是一種游離甲狀腺激素，其能通過(guò)透過(guò)血管屏障與靶細(xì)胞結(jié)合從而發(fā)揮作用?；加屑谞钕僦卸景Y[5]、突眼性甲狀腺功能亢進(jìn)癥[6]、無(wú)痛性甲狀腺炎伴甲亢[7]、亞急性甲狀腺炎伴甲亢[8]、甲狀腺激素不應(yīng)癥[9]的患者多表現(xiàn)為游離甲狀腺素(FT4)的升高；患有甲狀腺功能減退(原發(fā)性)[10]和低白蛋白血癥患者[11]多表現(xiàn)為游離甲狀腺素(FT4)的降低。FT4可以作為區(qū)分甲亢，甲減及甲功的亞臨床狀態(tài)，是一種反應(yīng)甲狀腺功能的靈敏指標(biāo)。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的進(jìn)步，有研究發(fā)現(xiàn)，甲狀腺激素水平不僅能夠反應(yīng)甲狀腺相關(guān)疾病，其與糖尿病[12]的發(fā)生、妊娠婦女胎兒的健康[13]、產(chǎn)后抑郁[14]等有相關(guān)性。研究表明，甲狀腺功能的改變與糖尿病的發(fā)生相關(guān)，即使FT4指標(biāo)在正常范圍內(nèi)，高水平的 FT4 與降低糖尿病的發(fā)生仍然相關(guān)[12]。妊娠婦女合并TSH降低、FT4升高，表現(xiàn)為妊娠期甲亢，甲亢婦女代謝相對(duì)旺盛，此時(shí)胎兒能量相對(duì)不足，因此，新生兒容易出現(xiàn)顱骨發(fā)育不全，呼吸困難、心衰等癥狀，因此妊娠期檢測(cè)FT4指標(biāo)對(duì)于新生兒的健康具有重要意義[13]。有研究表明，妊娠婦女產(chǎn)前低濃度水平的FT4與產(chǎn)后 18周內(nèi)出現(xiàn)產(chǎn)后抑郁相關(guān)[14]，妊娠婦女產(chǎn)后第4天低濃度水平的FT4與產(chǎn)后第1周抑郁的發(fā)生有關(guān)[15]。

電化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)在我國(guó)臨床醫(yī)學(xué)方面得到了廣泛的應(yīng)用，主要用于監(jiān)測(cè)疾病方面，是一種標(biāo)記性免疫分析技術(shù)[16],電化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)具有高穩(wěn)定性、高靈敏度、檢測(cè)準(zhǔn)確、無(wú)毒無(wú)害等優(yōu)勢(shì)[17]。電化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)對(duì)于微量物質(zhì)的檢測(cè)具有重要的價(jià)值[18]。電化學(xué)發(fā)光免疫分析不僅自動(dòng)化程度高,而且重復(fù)性也高,其對(duì)于提高臨床檢查的準(zhǔn)確率十分重要,有研究表明，電化學(xué)發(fā)光免疫分析方法檢測(cè)FT4的檢出率顯著高于免疫放射檢出率[19]，因此電化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)更能夠準(zhǔn)確的提供患者所需臨床檢測(cè)結(jié)果。電化學(xué)發(fā)光免疫分析法現(xiàn)在多用于細(xì)菌及病毒、激素和腫瘤標(biāo)記物的檢測(cè)等[20]，具有良好的應(yīng)用前景。電化學(xué)發(fā)光免疫分析在病毒的檢測(cè)應(yīng)用方面，可以檢測(cè)HIV、乙肝等病毒的抗原和抗體，具有快速準(zhǔn)確的特點(diǎn)，適合臨床篩查疾病；電化學(xué)發(fā)光免疫分析可以檢測(cè)多種激素以及腫瘤標(biāo)記物，如性激素6項(xiàng)、胰島素等，其不僅線性范圍廣，而且靈敏度更高。

該研究采用了競(jìng)爭(zhēng)電化學(xué)發(fā)光法的原理檢測(cè)人血清中FT4濃度，其中，反應(yīng)體系中三聯(lián)吡啶釕的發(fā)光效率很高，不需要催化劑，并且具有較高的靈敏度；鏈酶親合素包被的磁珠對(duì)生物素的結(jié)合力非常強(qiáng)，因此可以增加反應(yīng)體系的靈敏度；本反應(yīng)總檢測(cè)時(shí)間18 min，可高效快速的檢測(cè)血清總FT4含量。

綜上所述，該方法具有高靈敏度、高準(zhǔn)確度、線性范圍廣、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，所有指標(biāo)皆符合臨床檢測(cè)的要求。與Roche FT4試劑盒相比較，檢測(cè)結(jié)果一致性好，具有較好的臨床應(yīng)用前景。