廉 靜，張露文，陳勃同

(1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院 醫(yī)務(wù)科，黑龍江 哈爾濱150001；2.澳門(mén)科技大學(xué)；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué))

宮頸癌是常見(jiàn)的婦科腫瘤之一，盡管手術(shù)、放療、化療和放化療聯(lián)合等先進(jìn)治療手段提高了總體生存率，但是因?yàn)槟退幒蛷?fù)發(fā)等因素，晚期或者發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的宮頸癌病人預(yù)后較差，5年生存率較低[1]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類(lèi)小的(長(zhǎng)度為19-25個(gè)核苷酸)不具有編碼功能的非編碼RNA分子，通過(guò)結(jié)合靶基因的mRNA的3′-UTR(非編碼區(qū))來(lái)參與基因表達(dá)及功能的調(diào)控[2]。國(guó)內(nèi)外研究表明，miRNA在多種生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮不可替代的調(diào)節(jié)作用，例如發(fā)育、DNA損傷修復(fù)和分化、細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等。此外，miRNA失調(diào)與癌癥和其他人類(lèi)疾病的發(fā)生有關(guān)，其作為癌基因或腫瘤抑制因子參與各種癌癥(包括宮頸癌)的病理生理過(guò)程[3]。本實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)了3種不同類(lèi)型宮頸組織中miR-612的水平，并研究了HeLa 細(xì)胞中miR-612表達(dá)變化時(shí)相應(yīng)的細(xì)胞增殖率變化趨勢(shì)，以期加深對(duì)miR-612在宮頸癌中的認(rèn)識(shí)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

HeLa(人宮頸癌細(xì)胞)購(gòu)自武漢普諾賽(Procell)生命科技有限公司；miRNA-612 mimics(miRNA-612模擬物)以及與其匹配的陰性對(duì)照(NC)購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司 ； DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó) Gibco 公司；胰酶細(xì)胞消化液(0.25%胰酶)和Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；胎牛血清購(gòu)自四季青生物科技有限公司；Trizol 購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司 ；將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA所用的試劑盒購(gòu)自上海東洋紡(TOYOBO)生物科技有限公司；SYBR Green試劑盒購(gòu)自美國(guó)Roche公司；RT-PCR實(shí)驗(yàn)中涉及到的U6和miR-612 mRNA的引物序列均由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成。

1.2 組織標(biāo)本

選取并收集130例2019年1月—2021年3月就診于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院的宮頸癌患者經(jīng)手術(shù)切除的宮頸癌組織以及癌旁組織。收集120例經(jīng)病理學(xué)檢測(cè)正常的宮頸組織。所有患者平均年齡50.62±6.29歲，排除術(shù)前接受放療、化療或其他接受抗癌治療的患者。收集的所有組織標(biāo)本均于手術(shù)取出后立即保存在液氮中，并轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱保存，待進(jìn)一步檢測(cè)。本研究經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均知情同意。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

在37℃、5%二氧化碳濃度的環(huán)境中，用DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng) HeLa 細(xì)胞，DMEM中添加10%的優(yōu)質(zhì)胎牛血清以及青霉素-鏈霉素溶液。應(yīng)用 Lipofectamine法將miR-NC和miRNA-612 mimics 轉(zhuǎn)染到miR-NC組和miR-612 mimics組細(xì)胞中，僅添加轉(zhuǎn)染試劑組為正常對(duì)照組。轉(zhuǎn)染6 h后，將細(xì)胞消化每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h 后，方可進(jìn)行接下來(lái)的相關(guān)檢測(cè)。

1.4 RT- PCR 檢測(cè) miRNA-612 mRNA 表達(dá)

取不同組織標(biāo)本和3組HeLa細(xì)胞，用TRIzol法提取總RNA，并檢測(cè)RNA 濃度和純度，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明，將提取的總RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,根據(jù)SYBR Green 試劑說(shuō)明書(shū)，制備 10 μl反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增。U6作為內(nèi)參對(duì)照， miRNA-612 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平采用 2-△△Ct法進(jìn)行計(jì)算。

1.5 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況

待轉(zhuǎn)染完成后，收集并用DMEM重懸細(xì)胞，分別將3組細(xì)胞懸液接種于96孔板中，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，每孔加入100 μl DMEM，含有細(xì)胞數(shù)量為5×103個(gè)，在第0 h、12 h、24 h、 36 h和48 h分別向相應(yīng)的培養(yǎng)孔中加入CCK-8試劑10 μl，37℃條件繼續(xù)孵育3.5 h,酶標(biāo)儀測(cè)定630 nm 處相應(yīng)的吸光值，計(jì)算細(xì)胞增殖率。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 miRNA-612在3種組織中的表達(dá)

宮頸癌組織中miRNA-612的相對(duì)表達(dá)低于正常宮頸組織和宮頸癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) ，提示miRNA-612 在宮頸癌組織中低表達(dá)；正常宮頸組織和宮頸癌旁組織中miRNA-612的相對(duì)表達(dá)水平無(wú)明顯差異(P>0.05)。 見(jiàn)表1。

表1 組織標(biāo)本中miRNA-612的表達(dá)水平

2.2 miRNA-612在3組細(xì)胞中的表達(dá)

miR-612 mimics組中的miRNA-612的相對(duì)表達(dá)水平明顯高于其在正常對(duì)照組和 miR-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示轉(zhuǎn)染成功，且miRNA-612在細(xì)胞中成功高表達(dá)；miRNA-612在正常對(duì)照組和 miR-NC組中的表達(dá)水平相近，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 miRNA-612在3組細(xì)胞中的表達(dá)水平

2.3 3組細(xì)胞的增殖情況

與正常對(duì)照組和 miR-NC組相比，miR-612 mimics組細(xì)胞增殖率減低，差異明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，即在HeLa 細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-612后，可以抑制HeLa 細(xì)胞的增殖；而正常對(duì)照組和 miR-NC組細(xì)胞增殖率相比，差異不明顯(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 3組細(xì)胞的增殖率(%)

3 討論

大量研究發(fā)現(xiàn)，miRNA是多種疾病發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵調(diào)節(jié)者，也是一類(lèi)有前景的治療靶點(diǎn)[4]。隨著多種miRNA被發(fā)現(xiàn)，癌癥的分子機(jī)制和診療策略得到了更深入的發(fā)掘，其在癌癥中的作用越來(lái)越受到關(guān)注[5]。

近年來(lái)，宮頸癌的發(fā)病率和死亡率均呈現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)，但是在一些發(fā)展中國(guó)家還是持續(xù)在較高水平[6]。因此，完善宮頸癌的發(fā)病機(jī)制，探尋與診斷、治療和預(yù)后相關(guān)的生物學(xué)標(biāo)志物已成為研究工作的重點(diǎn)。有證據(jù)表明，宮頸癌組織中許多miRNA的表達(dá)發(fā)生變化，在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[7]。進(jìn)一步探究miRNA在宮頸癌中的調(diào)控功能及其可能的分子機(jī)制可能有助于確定診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。有研究顯示，MiR-612在肝癌中負(fù)調(diào)控肝癌侵襲性瘤體形成、基質(zhì)降解、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移[8]，此外，MiR-612在子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、膀胱癌、結(jié)腸癌、胃癌、黑色素瘤中也被不同程度的下調(diào)，暗示其發(fā)揮潛在的抑制腫瘤的作用[9]。但是，miR-612在宮頸癌中的表達(dá)情況以及發(fā)揮的相關(guān)作用還沒(méi)有確切的報(bào)道。

本研究分別檢測(cè)了3種不同宮頸類(lèi)型組織中miR-612的水平并進(jìn)行比較，確定了miR-612與宮頸癌相關(guān)。此外，培養(yǎng)HeLa細(xì)胞，并通過(guò)轉(zhuǎn)染使miR-612在細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，與未經(jīng)處理的HeLa細(xì)胞以及轉(zhuǎn)染對(duì)照的HeLa細(xì)胞進(jìn)行比較。組織標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果表明，與正常宮頸組織和宮頸癌旁組織相比，miR-612在宮頸癌組織中呈現(xiàn)出低表達(dá)趨勢(shì)。體外功能實(shí)驗(yàn)表明，過(guò)表達(dá)miR-612后的HeLa細(xì)胞與未經(jīng)處理的HeLa細(xì)胞以及轉(zhuǎn)染對(duì)照的HeLa細(xì)胞相比增殖率明顯減低，說(shuō)明miR-612可抑制HeLa細(xì)胞的增殖。

綜上，miR-612在宮頸癌中表達(dá)減低， miR-612在體外抑制宮頸癌細(xì)胞增殖，這表明miR-612可能對(duì)宮頸癌具有抗癌作用，很有可能在未來(lái)的宮頸癌診斷、治療管理中發(fā)揮重要作用，然而其明確的臨床意義還需要進(jìn)行大量研究加以論證。