胡艷萍

(鄭州大學(xué)附屬洛陽中心醫(yī)院 兒科,河南 洛陽471000)

川崎病(Kawasaki disease，KD)是一種常見的小兒急性血管炎綜合征，發(fā)病率呈逐年上升趨勢，主要累及冠狀動脈，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致多種并發(fā)癥，包括冠狀動脈擴(kuò)張、狹窄甚至閉鎖，以及冠狀動脈瘤[1]。目前，據(jù)估計(jì)KD已成為兒童獲得性心臟病的常見病因[1]。KD的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，涉及多種原因和因素，如單核巨噬細(xì)胞參與的免疫激活、一氧化氮(NO)和基質(zhì)金屬蛋白酶[2]參與的血管損傷等。在Caspase家族中，Caspase-1、Caspase-4和Caspase-5與炎癥因子密切相關(guān)，其中Caspase-4可通過下調(diào)白細(xì)胞介素-1β (IL-1β)的前體來促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子的成熟[3]。Caspase-4(Casp4)除了與細(xì)胞因子的產(chǎn)生有關(guān)外，還參與細(xì)胞凋亡。研究表明，核因子-κB (NF-κB)通過調(diào)節(jié)炎癥因子的表達(dá)，在KD所致血管炎中發(fā)揮重要作用[4]。據(jù)報(bào)道，神經(jīng)母細(xì)胞瘤中NF-κB介導(dǎo)Casp4的蛋白表達(dá)，從而參與細(xì)胞凋亡[5]。NF-κB可被多種細(xì)胞因子激活，目前的研究主要集中在腫瘤壞死因子家族成員腫瘤壞死因子-α(TNF-α)。這些研究結(jié)果證實(shí)，TNF-α可以激活NF-κB。目前，尚不清楚Casp4及NF-κB信號通路是否與KD的病理時(shí)期有關(guān)。另外，冠狀動脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷是KD發(fā)生的主要病理現(xiàn)象。內(nèi)皮細(xì)胞主要由活化的白細(xì)胞產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)通過活化NF-κB信號通路來激活[6]。因此，本研究旨在考察小兒KD不同病理時(shí)期單核細(xì)胞中Casp4和NF-κB信號通路相關(guān)因子的表達(dá)，以及Casp4和NF-κB信號通路相關(guān)因子在TNF-α誘導(dǎo)的HCAEC損傷中的作用，從而為KD的診斷和治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

2018年3月至2020年12月，收集鄭州大學(xué)附屬洛陽中心醫(yī)院確診的100例KD患兒(KD組)，包括男性61例，女性39例，年齡為8個(gè)月-7歲，平均為2.33±1.62歲。納入本研究的KD患兒均符合KD診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]。KD患兒均接受靜脈注射免疫球蛋白(IVIG)(2 g/kg)和阿司匹林口服治療。按照病情發(fā)展時(shí)期將KD患兒分為急性期(發(fā)病后1-2周內(nèi))和緩解期(發(fā)病4周后)。另外，選取我院同期體檢的30例健康兒童作為對照組，包括男性18例，女性12例，年齡為10個(gè)月-6歲，平均為2.36±1.43歲。KD患兒和健康對照兒童的基線資料如表1所示。兩組的年齡和性別組成無差異(P>0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象均經(jīng)父母或監(jiān)護(hù)人簽訂知情同意書。

表1 受試者的基線資料

1.2 PBMC中NF-κB p65活性的檢測

抽取5 ml受試者外周靜脈血，肝素抗凝，將各組外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)采用淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心后分離出來，-80℃冰箱保存。通過ELISA試劑盒檢測PBMC中NF-κB p65活性，檢測方法參考試劑盒說明書(武漢菲恩生物科技有限公司)。

1.3 血清中Casp4、TNF-α和IL-6活性的檢測

抽取5 ml受試者外周靜脈血，3 000 r/min離心 15 min，收集上層血清，通過ELISA試劑盒檢測血清中Casp4、TNF-α和IL-6活性，檢測方法參考試劑盒說明書(上海拜力生物科技公司)。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

將HCAEC細(xì)胞(美國ATCC)在含有10% FBS、1%青霉素-鏈霉素的DMEM(美國GIBCO)中于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。指定時(shí)間點(diǎn)用含有10 ng/mL TNF-α的新培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基。

1.5 細(xì)胞分組及處理

將HCAEC細(xì)胞分為Control組、TNF-α組、TNF-α+ SN50組。將HCAEC細(xì)胞(1×105個(gè)/mL)接種在6孔板中，每孔加2 ml細(xì)胞懸液，37℃、5% CO2過夜培養(yǎng)。細(xì)胞生長至60%-70%融合時(shí)，TNF-α組細(xì)胞用10 ng/mL TNF-α(美國OriGene)刺激細(xì)胞4 h。TNF-α+SN50組細(xì)胞用10 ng/mL TNF-α和5 ng/ml NF-κB抑制劑SN50(德國Merck)刺激細(xì)胞4 h。Control組細(xì)胞正常培養(yǎng)。

1.6 Western blot

蛋白提取試劑盒(江蘇凱基)提取HCAEC細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒(上海碧云天)測定蛋白質(zhì)濃度。通過10% SDS-PAGE電泳分離蛋白并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜。室溫下用含5%脫脂奶粉封閉膜20 min。將膜與一抗(NF-κB p65、I-κBα、Casp4、TNF-α、IL-6、Lamin B1和β-actin一抗，1∶1 000稀釋，均購自美國Cell Signaling Technology)4℃過夜孵育。然后將膜與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶2000稀釋，美國Cell Signaling Technology)室溫孵育2 h。ECL進(jìn)行顯影。Lamin B1和β-actin作為內(nèi)部對照。

1.7 單核細(xì)胞粘附測定法

將HCAEC細(xì)胞接種在24孔板中至80%-90%融合，然后用10 ng/mL TNF-α或5 ng/ml SN50刺激細(xì)胞4 h。將THP1細(xì)胞在RPMI-1640培養(yǎng)基中用2 μM BCECF-AM(美國Sigma)標(biāo)記20 min，然后添加到HCAEC細(xì)胞(5×104細(xì)胞/孔)中培養(yǎng)30 min。然后使用含1% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基清洗每個(gè)孔3次，用于除去未粘附的THP1細(xì)胞。熒光顯微鏡下觀察粘附的THP1細(xì)胞。使用熒光微板讀取器以510 nm的激發(fā)和531 nm的發(fā)射波長來測量熒光強(qiáng)度，并計(jì)算平均熒光強(qiáng)度(MFI)/細(xì)胞。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件用于數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料表示為例數(shù)，兩組間比較采用卡方檢驗(yàn)；正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析；非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)間距表示，兩組間比較采用非參數(shù)Mann Whitney U檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KD患兒和健康兒童的PBMC中NF-κB p65活性及血清中TNF-α、IL-6和Casp4活性

KD患兒和健康兒童PBMC中NF-κB p65活性及血清中TNF-α、IL-6和Casp4活性如表2所示。與對照組比較，KD組患兒的PBMC中NF-κB p65活性及血清中TNF-α、IL-6和Casp4活性均顯著升高(P<0.001)。

表2 KD患兒和健康兒童的PBMC中NF-κB p65活性及血清中TNF-α、IL-6和Casp4活性

2.2 不同病理時(shí)期KD患兒的PBMC中NF-κB p65活性及血清中TNF-α、IL-6和Casp4活性

急性期和緩解期KD患兒PBMC中NF-κB p65活性及血清中TNF-α、IL-6和Casp4活性如表3所示。與急性期比較，緩解期KD患兒的PBMC中NF-κB p65活性及血清中TNF-α、IL-6和Casp4活性均顯著下降(P<0.001)。

表3 急性期和緩解期KD患兒的PBMC中NF-κB p65活性及血清中TNF-α、IL-6和Casp4活性

2.3 NF-κB抑制劑SN50對TNF-α誘導(dǎo)的HCAEC細(xì)胞中的Casp4和NF-κB信號通路相關(guān)因子的影響

圖1顯示，與Control組相比，TNF-α組HCAEC細(xì)胞中的NF-κB p65、Casp4、TNF-α和IL-6的蛋白相對表達(dá)量均顯著升高，而I-κBα顯著降低(P<0.001)。與TNF-α組相比，TNF-α+SN50組HCAEC細(xì)胞中的NF-κB p65、Casp4、TNF-α和IL-6的蛋白相對表達(dá)量均顯著降低，而I-κBα顯著升高(P<0.001)。

圖1 NF-κB抑制劑SN50對TNF-α誘導(dǎo)的HCAEC細(xì)胞中的Casp4和NF-κB信號通路相關(guān)因子的影響

2.4 NF-κB抑制劑SN50對TNF-α誘導(dǎo)的HCAEC細(xì)胞與單核細(xì)胞粘附的影響

通過單核細(xì)胞粘附測定法檢測了NF-κB抑制劑SN50對TNF-α誘導(dǎo)的HCAEC細(xì)胞與單核細(xì)胞粘附的影響。圖2顯示，與Control組相比，TNF-α組粘附實(shí)驗(yàn)的相對熒光強(qiáng)度顯著升高 (P<0.001)。與TNF-α組相比，TNF-α+SN50組粘附實(shí)驗(yàn)的相對熒光強(qiáng)度顯著降低 (P<0.001)。

圖2 NF-κB抑制劑SN50對TNF-α誘導(dǎo)的HCAEC細(xì)胞與單核細(xì)胞粘附的影響

3 討論

NF-κB的激活可以調(diào)節(jié)多種炎癥因子、生長因子和粘附分子的表達(dá)，參與炎癥過程、免疫反應(yīng)和細(xì)胞凋亡[8-9]。研究表明，NF-κB的激活通過調(diào)節(jié)炎癥因子的表達(dá)，在KD血管炎的病理發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用[4]?，F(xiàn)已證實(shí)，小兒KD急性期患者外周血中的CD14+單核/巨噬細(xì)胞和CD3+T細(xì)胞中存在NF-κB的活化。靜脈輸注免疫球蛋白通過抑制NF-κB活化已成為KD的首選治療方法。TNF-α和IL-6均是NF-κB調(diào)節(jié)的下游炎癥因子[6,10-11]。位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外膜上的Casp4已被發(fā)現(xiàn)與應(yīng)激相關(guān)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡有關(guān)[12]。此外，也有研究表明Casp4在TRAIL誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中起重要作用[13]。本研究結(jié)果顯示，與健康兒童相比，KD患兒的PBMC中NF-κB p65活性及血清中TNF-α、IL-6和Casp4活性均顯著升高。此外，與急性期比較，緩解期KD患兒的PBMC中NF-κB p65活性及血清中TNF-α、IL-6和Casp4活性均顯著下降(P<0.001)。上述結(jié)果說明Casp4和NF-κB信號通路不僅參與KD的發(fā)生，而且與KD患兒的預(yù)后密切相關(guān)，有望成為評價(jià)KD治療的預(yù)后指標(biāo)。

其他文獻(xiàn)報(bào)道，在KD患者中，NF-κB信號通路激活后可引起Casp4的高表達(dá)，兩者存在線性關(guān)系[14]。為了進(jìn)一步考察Casp4和NF-κB信號通路在KD中的作用機(jī)制，本研究考察了NF-κB抑制劑SN50對TNF-α誘導(dǎo)的HCAEC的調(diào)控作用。內(nèi)皮細(xì)胞的激活可加重KD損傷[6]，內(nèi)皮細(xì)胞主要由活化的白細(xì)胞產(chǎn)生的促炎細(xì)胞因子通過激活NF-κB信號通路來激活[6]。TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB活化會刺激人內(nèi)皮細(xì)胞中促炎介質(zhì)的產(chǎn)生[6,10-11]。本研究結(jié)果顯示TNF-α加重了HCAEC細(xì)胞中的炎癥反應(yīng)。然而，NF-κB抑制劑SN50抑制了TNF-α誘導(dǎo)的HCAEC細(xì)胞中NF-κB的核易位，并上調(diào)了其抑制劑I-κBα的表達(dá)，此外，也抑制了該通路下游炎癥因子的水平。SN50同樣抑制了TNF-α誘導(dǎo)的HCAEC細(xì)胞中Casp4的表達(dá)，這些結(jié)果提示在KD相關(guān)HCAEC細(xì)胞炎癥損傷中，NF-κB信號通路直接調(diào)控Casp4的表達(dá)。另外，循環(huán)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附是重要的炎癥過程[15]。本研究結(jié)果顯示，NF-κB抑制劑SN50抑制了NF-κB的核易位，進(jìn)而抑制了Casp4及促炎介質(zhì)的的釋放，隨后抑制HCAEC細(xì)胞與單核細(xì)胞粘附，最終減輕TNF-α誘導(dǎo)的HCAEC細(xì)胞損傷。

總之，本研究表明，與急性期相比，緩解期KD患兒的Casp4和NF-κB信號通路相關(guān)因子的活性顯著降低。此外，NF-κB抑制劑SN50可抑制TNF-α誘導(dǎo)的HCAEC細(xì)胞中Casp4和NF-κB信號通路相關(guān)因子的活性以及HCAEC細(xì)胞與單核細(xì)胞粘附。