李陽

（江蘇省人民醫(yī)院，江蘇 南京，210029）

支氣管哮喘是一種以反復(fù)發(fā)作的咳嗽、喘息、胸悶及呼吸困難為表現(xiàn)，兒童時期最常見的慢性氣道高反應(yīng)性疾病。全國兒科哮喘協(xié)作組曾先后進(jìn)行過三次全國規(guī)模的兒童哮喘患病率調(diào)查，提示我國兒童哮喘的患病率呈顯著上升趨勢。哮喘的病因及發(fā)病機(jī)制極為復(fù)雜，涉及到遺傳、特應(yīng)性體質(zhì)、環(huán)境、飲食、氣道高反應(yīng)性、性別、肥胖、藥物等多個方面。哮喘不僅影響個人的生活質(zhì)量，也給家庭及社會造成了沉重的精神和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，亦消耗著巨大的醫(yī)療衛(wèi)生資源[1]。

由于兒童哮喘的高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率、高危險(xiǎn)性的特點(diǎn)，作為兒童呼吸科最常見的疾病，一直以來都是兒童醫(yī)院呼吸領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)[2]-[3]。雖然GINA 方案得到大力普及和推廣，但由于個體遺傳背景的差異，使得患兒對于β2 受體激動劑及ICS（吸入性糖皮質(zhì)激素）的敏感度不同，治療的效果以及遠(yuǎn)期肺功能變化情況也存在較大變異，因此，本研究旨在探討哮喘患兒ADRB2、GLCCI1、FCER2 基因多態(tài)性與患兒哮喘治療效果以及肺功能變化的關(guān)系，以期為提升此類患者的臨床治療效果提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料收集2016年11月至2018年6月期間本院收治的哮喘患兒為研究對象，跟蹤隨訪其治療效果以及最新一次的肺功能檢測結(jié)果，并按照相關(guān)定義分為不同的臨床轉(zhuǎn)歸組。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡0～16 歲；經(jīng)本院呼吸內(nèi)科確診為“支氣管哮喘”或“變異性哮喘”的患兒；所有患兒均為初次確診，并未接受過相關(guān)治療；患兒監(jiān)護(hù)人同意參與本研究，并簽署了知情同意書者。排除標(biāo)準(zhǔn)：既往接受過哮喘相關(guān)治療的患兒；合并有其他嚴(yán)重呼吸系統(tǒng)疾病的患兒；患有嚴(yán)重的感染性疾病或運(yùn)動系統(tǒng)疾病，不能耐受激素治療的患兒；監(jiān)護(hù)人拒絕參與研究的。

1.2 方法治療效果的定義，所有患兒均根據(jù)其臨床狀況采用ICS 與β2 受體激動劑聯(lián)用的治療方案，按照患兒治療后的臨床轉(zhuǎn)歸定義為治療效果好與治療效果一般，治療效果好指哮喘癥狀部分或全部控制，在臨床醫(yī)師的指導(dǎo)下減藥或停藥的患者；治療效果一般指哮喘癥狀未得到有效控制，或調(diào)整藥量后出現(xiàn)反復(fù)的患者。

肺功能檢測定義，按照患兒最近一次肺功能檢測的結(jié)果進(jìn)行分組，肺功能無異?；驓獾拦δ芨纳频幕颊邽榉喂δ苷＝M，存在氣道改變或舒張?jiān)囼?yàn)陽性的患者定義為肺功能異常。生物樣本的采集與測定：用熒光染色原位雜交技術(shù)對GLCCI1、ADRB2、FCER2 進(jìn)行基因分型，抽取患兒2ml 靜脈血，從血液樣本提取核酸：將待檢血液標(biāo)本顛倒混勻數(shù)次；10× 紅細(xì)胞裂解液（氯化銨）與滅菌水按1∶9 比例稀釋到工作液（1× 紅細(xì)胞裂解液）濃度；取1.5ml 離心管，加入1.2ml 紅細(xì)胞裂解液（工作液），取200μl 待檢標(biāo)本加入離心管中，上下顛倒混勻，室溫靜置5min；將離心管放入離心機(jī)中，離心5min，轉(zhuǎn)速：3000r/min；或700× g 離心完成后取出離心管，用槍頭吸去上清，保留沉淀；緊貼管壁，緩慢加入適量0.9%氯化鈉溶液（約500～1000μl），清洗管壁和白細(xì)胞表面（注意不要將白細(xì)胞吹起），棄上清。（如白細(xì)胞紅色較重可直接加入1000μl 的0.9%氯化鈉溶液，混勻，離心5min，轉(zhuǎn)速：3000r/min；或700× g，棄上清）；加入50～100μl 耀金保，混勻，室溫靜置30min。取1.5μl 最后一步的混合液加入到1 支耀金分中，充分混勻；組織蠟片直接加入耀金分中，用移液槍頭搗碎，并至液面下，將混勻后的樣本順序放入檢測儀器中，關(guān)閉儀器封蓋。對儀器進(jìn)行相應(yīng)設(shè)置，運(yùn)行儀器，進(jìn)行檢測。

SNP 的選取原則依據(jù)下述原則挑選本研究所需的SNP：①確認(rèn)有效狀態(tài)（確認(rèn)該SNP 在中國群體中被有效證明）；②雜合度，要求最小等位基因頻率（minorallelefrequencies，MAF）＞0.1，一個SNP 的兩個等位基因的出現(xiàn)頻率越高，獲得雜合子越容易，從而可以確保較高的雜合性，提高統(tǒng)計(jì)功效；③既往研究中證明了該SNP 在哮喘治療中效果影響的有效性；④在多個來源的SNP 數(shù)據(jù)庫中有報(bào)道。

1.3 數(shù)據(jù)收集與分析本研究中研究對象的一般信息以及目的基因的檢測信息收集完成后由兩位數(shù)據(jù)錄入人員使用Epidata3.0 進(jìn)行雙錄入建立數(shù)據(jù)庫，在分析之前使用SHEsis 軟件對各S NP 進(jìn)行Hardy-Weinbergequilibrium（HWE）檢驗(yàn)，使用SAS9.4 構(gòu)建不同的遺傳模型，并檢驗(yàn)在各模型下各SNP 基因多態(tài)性在不同組間患者內(nèi)分布的差異,使用logistic 回歸模型校正年齡、性別、病程等因素的影響，本研究的檢驗(yàn)水準(zhǔn)統(tǒng)一設(shè)置為0.05。

2 結(jié)果

2.1 研究對象的一般特征情況83 例研究對象中，男52 例（62.65%）；所有研究對象中，年齡3～16 歲，平均年齡（10.64± 2.89）歲。其中被診斷為支氣管哮喘者10 人，診斷為咳嗽變異性哮喘者73 人；病程＜2年的有19 例（22.89%），病程在2～5年的有51 例（61.44%），病程＞5年的有13 例（15.66%），見表1。

表1 83 例研究對象的一般特征

2.2 目標(biāo)SNP 信息以國家基因數(shù)據(jù)庫CNGB 為數(shù)據(jù)源，依據(jù)SNP的挑選原則挑選目標(biāo)SNP，最終納入3 個目標(biāo)SNP 為研究對象（ADRB2 基因的rs1042713 位點(diǎn)，GLCCI1 的rs37973 位點(diǎn)，F(xiàn)CER2的rs28364072 位點(diǎn)），三個位點(diǎn)的基因信息經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)結(jié)果顯示，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；rs1042713 位點(diǎn)的應(yīng)答率為95.8%，rs37973、rs28364072 兩位點(diǎn)的應(yīng)答率均為100%，各SNP 的信息，見表2。

表2 目標(biāo)SNP 信息

2.3 藥物受體基因多態(tài)性與患兒治療效果的關(guān)系按照患兒的治療轉(zhuǎn)歸分組后，比較不同治療結(jié)局間各SNP 基因型的分布差異，結(jié)果顯示，對于ADRB2 基因型的rs1042713 位點(diǎn)，在各遺傳模型下基因型的分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；對于GLCCI1 基因的rs37973 位點(diǎn)，在加性模型以及顯性模型下，基因型的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）,顯性模型下的結(jié)果顯示，GG 基因型的患兒發(fā)生治療結(jié)果不良的風(fēng)險(xiǎn)是GA 以及AA 基因型患兒的18.20 倍（95%CI：4.92～67.26）；對于FCER2 基因的rs28364072 位點(diǎn)，加性模型與隱性模型下差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表3。

表3 各SNP 與哮喘患兒治療效果的關(guān)系

2.4 藥物應(yīng)答基因與患者肺功能的關(guān)系在不同遺傳模型下對各基因目標(biāo)SNP 基因型在肺功能正常與異常患者間分布差異的檢測結(jié)果顯示，對于ADRB2，在隱性模型下，目標(biāo)SNP 基因型在不同肺功能檢測結(jié)果患者間分布差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，GG 基因型的患者發(fā)生肺功能異常的風(fēng)險(xiǎn)僅為GA 與AA 基因型的0.32倍（95%CI：0.12～0.87），對于GLCCI1，目標(biāo)SNP 各基因型在不同遺傳模型下與不同肺功能檢測結(jié)果患者間分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對于FCER2，在加性模型、顯性模型下目標(biāo)SNP 的各基因型在不同肺功能檢測結(jié)果的患者間分布差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表4。

表4 各基因目標(biāo)SNP 基因型與患者肺功能變化的關(guān)系

3 討論

本研究的目的旨在從遺傳機(jī)制以及分子層面探討影響小兒哮喘治療效果的因素，以期加深對于此類疾病治療分子機(jī)制的理解，從而提升臨床治療效果。結(jié)果顯示，ADRB2、GLCCI1、FCER2 三個基因的多態(tài)性均與小兒哮喘治療效果或患兒臨床肺功能轉(zhuǎn)歸相關(guān)[4]-[5]。

既往研究證明[6]-[7]，ADRB2 基因的表達(dá)及功能可影響以β 2-腎上腺素受體為作用靶點(diǎn)的支氣管擴(kuò)張劑（包括β受體激動劑、茶堿類、抗膽堿類藥物等）的藥物效應(yīng)，因此，其多態(tài)性可能作為影響因素對使用β2 腎上腺素受體激動劑作為哮喘治療手段的患兒長期預(yù)后造成影響，本研究結(jié)果顯示，對于ADRB2基因rs1042713 位點(diǎn)基因型為GG 的患兒，GA 以及AA 基因型的患兒發(fā)生肺功能異常的風(fēng)險(xiǎn)更高，與Lipworth，Zuurhout 等在國外成年哮喘患者中所得的研究結(jié)論相一致。此外，本課題組在同樣遺傳背景的患兒中進(jìn)行的前期研究中也發(fā)現(xiàn)在難治性哮喘患兒中，ADRB2AA 型者，停用β2 受體激動劑，給予噻托溴銨后，患兒哮喘得到明顯控制，提示此基因作為小兒哮喘個體化治療依據(jù)的意義。

糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄基因1（glucocorticoid-inducedtranscript1gene，GLCCI1）位于人類染色體組的7 號染色體上，其編碼一種功能尚不清楚但由糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白。既往研究的結(jié)果顯示，此種蛋白質(zhì)可能是糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的早期標(biāo)志物，因此其表達(dá)水平可以影響到糖皮質(zhì)激素生理作用的大小，兩項(xiàng)關(guān)于糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄基因多態(tài)性研究發(fā)現(xiàn)，rs37973 位點(diǎn)G 等位基因與治療反應(yīng)較差有關(guān)。與本研究的結(jié)果相互印證[8]-[9]。此外邱玉明等在中國漢族人群中的研究結(jié)果也證實(shí)了GLCCI1 基因多態(tài)性對于糖皮質(zhì)激素吸入治療哮喘療效的影響。

FCER2 位于人類染色體組第19 號染色體上，是一種蛋白編碼基因，其在調(diào)控IgE 生成中起著重要作用，是過敏性哮喘的重要介導(dǎo)因子。既往研究的結(jié)果證實(shí)，F(xiàn)CER2 基因rs28364072位點(diǎn)的多態(tài)性為與哮喘的嚴(yán)重程度、住院風(fēng)險(xiǎn)，住院時間有關(guān)。推測可能是由于在使用糖皮質(zhì)激素吸入療法治療哮喘時，F(xiàn)CER2基因突變的患者可通過提高IgE 表達(dá)水平加重氣道功能的異常，從而加劇不良反應(yīng)的程度[10]。本研究結(jié)果顯示，相較于FCER2基因rs28364072 位點(diǎn)為GA 或AA 的患者，GG 基因型的患者發(fā)生肺功能異常的風(fēng)險(xiǎn)更高，與Tantisira 等在國外哮喘患兒中進(jìn)行的研究結(jié)果一致，此外，Rogers 等的研究結(jié)果顯示，同一位點(diǎn)GG 基因型的患者，接受糖皮質(zhì)激素吸入治療時肺功能（FEV1%）惡化的相對危險(xiǎn)度（OR）為2.1，與本研究的結(jié)果相互印證。

既往關(guān)于哮喘的研究提示，此疾病為受基因與環(huán)境共同影響的多基因遺傳病，多種基因通過不同通路共同作用與哮喘的發(fā)病以及后續(xù)對治療的反應(yīng)，因此患者的治療效果變異較大，近些年來越來越多的證據(jù)提示基因診斷在哮喘治療中的價(jià)值，幾位專家[11]-[12]應(yīng)用ADRB2、GLCCI1、FCER2 三個基因多態(tài)性檢測有效提升了兩例小兒難治性哮喘中的治療效果，并且成功的降底了并發(fā)癥的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，與本研究的結(jié)果一致。

綜上所述，本研究的結(jié)果顯示，GLCCI1 基因的rs1042713位點(diǎn)、FCER2 基因多態(tài)性與哮喘患兒藥物治療效果相關(guān)，ADRB2、FCER2 基因多態(tài)性與哮喘患兒肺功能轉(zhuǎn)歸有關(guān)。提示了此三個基因多態(tài)性檢測結(jié)果在指導(dǎo)哮喘臨床用藥中的意義。