孫曉瑩，鄧雪蓉，李光韜，謝文慧，樊勇，張慧娟，楊新蕾，張卓莉

隨著達(dá)標(biāo)治療(treat to target, T2T)理念的提出，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)患者的治療目標(biāo)為疾病緩解或低疾病活動(dòng)度。在臨床緩解的關(guān)節(jié)中，通過關(guān)節(jié)超聲檢查仍可以發(fā)現(xiàn)亞臨床滑膜炎癥[1]。亞臨床滑膜炎的存在可預(yù)測(cè)RA復(fù)發(fā)及關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)破壞進(jìn)展[2]。

很少有研究關(guān)注RA亞臨床滑膜炎相關(guān)的血清學(xué)生物標(biāo)志物。先前研究發(fā)現(xiàn)，鈣衛(wèi)蛋白與人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)可作為在RA臨床緩解患者中識(shí)別超聲定義的活動(dòng)性滑膜炎的生物標(biāo)志物[3-4]。然而，上述標(biāo)志物仍需進(jìn)一步驗(yàn)證，目前尚未見關(guān)于RA亞臨床滑膜炎轉(zhuǎn)錄組學(xué)變化的研究。在既往研究中，RA的轉(zhuǎn)錄組分析通常集中在外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)[5]。本研究旨在探索RA亞臨床滑膜炎患者PBMC轉(zhuǎn)錄組學(xué)特點(diǎn)，研究亞臨床滑膜炎發(fā)生機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究前瞻性入選2019年5月至2019年7月就診于北京大學(xué)第一醫(yī)院風(fēng)濕免疫科臨床緩解的RA患者共10例，其中亞臨床滑膜炎組及超聲下緩解組患者各5例。定義所有關(guān)節(jié)超聲下能量多普勒(power doppler, PD)分級(jí)均為0級(jí)的患者為超聲下緩解組，任意一個(gè)關(guān)節(jié)PD≥1級(jí)的患者為亞臨床滑膜炎組。

RA患者納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合1987年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(American College of Rheumatology, ACR)或2010年ACR/歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟(European League Against Rheumatism, EULAR) RA分類標(biāo)準(zhǔn)；(2)年齡>18歲；(3)基于C反應(yīng)蛋白的28個(gè)關(guān)節(jié)疾病活動(dòng)度評(píng)分(disease activity score based on 28 joint count and CRP， DAS28-CRP)<2.6。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他關(guān)節(jié)炎性疾??；(2)存在關(guān)節(jié)明顯畸形或殘毀，或有缺如及外傷等。

本研究方案經(jīng)本院倫理委員會(huì)審批，獲得所有入組患者的口頭或書面知情同意。

1.2 臨床數(shù)據(jù)及全血標(biāo)本收集

所有患者在同一天完成臨床評(píng)估、實(shí)驗(yàn)室及超聲檢查，并用EDTA抗凝采血管采集所有患者外周靜脈血10 mL。記錄患者的臨床資料，包括姓名、性別、年齡、28個(gè)關(guān)節(jié)(包括雙側(cè)肩、肘、腕、膝、掌指關(guān)節(jié)[metacarpophalangeal, MCP]1-5和近端指間關(guān)節(jié)[proximal interphalangeal, PIP]1-5關(guān)節(jié))的腫脹關(guān)節(jié)計(jì)數(shù)(swollen joint counts, SJC)及壓痛關(guān)節(jié)計(jì)數(shù)(tender joint counts, TJC)、患者整體評(píng)估(patient’s global assessment, PGA)、評(píng)估者整體評(píng)估(evaluator’s global assessment，EGA)以及實(shí)驗(yàn)室資料，包括紅細(xì)胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate, ESR)及C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein, CRP)。通過DAS28-ESR、DAS28-CRP、簡(jiǎn)化臨床疾病活動(dòng)指數(shù)(simplified disease activity index, SDAI)、臨床疾病活動(dòng)指數(shù)(clinical disease activity index, CDAI)等指標(biāo)評(píng)估患者的疾病活動(dòng)度。應(yīng)用美國(guó)GE LOGIQ-E9型彩色超聲波診斷儀和ML探頭(6-15MHz)，分別從掌側(cè)及背側(cè)對(duì)28個(gè)關(guān)節(jié)及雙踝、雙跖趾關(guān)節(jié)(metatarsophalangeal, MTP)1-5關(guān)節(jié)共40個(gè)關(guān)節(jié)進(jìn)行超聲檢查評(píng)估滑膜炎?；译A(grey scale, GS)及PD超聲半定量分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)均按照Szkudlarek等[6]提出的0～3級(jí)半定量評(píng)分系統(tǒng)。

1.3 提取PBMC總RNA及檢測(cè)RNA

從患者新鮮的外周靜脈血中分離PBMC，用Trizol法進(jìn)行細(xì)胞總RNA提取。應(yīng)用Agilent 2100生物分析儀檢測(cè)總RNA的濃度、RIN/RQN值、28S/18S及片斷大小。

1.4 轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

使用BGISEQ平臺(tái)測(cè)序，測(cè)序所得數(shù)據(jù)為原始測(cè)序數(shù)據(jù)，隨后對(duì)其進(jìn)行質(zhì)控，以確定測(cè)序數(shù)據(jù)是否適合后續(xù)分析。質(zhì)控后，經(jīng)過濾得到過濾后的數(shù)據(jù)比對(duì)到參數(shù)序列。比對(duì)完，通過統(tǒng)計(jì)比對(duì)率、讀長(zhǎng)在參考序列上的分布情況，判斷比對(duì)結(jié)果是否通過第二次質(zhì)控。若通過，進(jìn)行基因定量分析、基于基因表達(dá)水平的各項(xiàng)分析，篩選出兩組間差異表達(dá)基因(differentially expressed genes,DEGs)，進(jìn)行GO功能顯著性富集分析、KEGG通路顯著性富集分析、聚類、蛋白網(wǎng)絡(luò)互作(protein-protein interaction,PPI)分析及轉(zhuǎn)錄因子深入挖掘分析。本研究使用DEseq2算法進(jìn)行差異基因檢測(cè)，采集差異倍數(shù)在兩倍以上且校正P值≤0.05篩選差異基因。應(yīng)用DIAMOND將DEGs對(duì)比至STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，利用與已知蛋白的同源性獲得DEG編碼蛋白的互作關(guān)系。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

計(jì)量資料先進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布計(jì)量資料用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，非正態(tài)分布的計(jì)量資料用中位數(shù)(四分位間距)表示；計(jì)數(shù)資料以率表示。組間計(jì)量資料均數(shù)比較采用兩個(gè)獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)(正態(tài)分布)。非正態(tài)分布計(jì)量資料的比較使用Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料兩組間比較用卡方檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)。用 SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床緩解RA存在亞臨床滑膜炎及超聲下緩解患者人口學(xué)資料及臨床特征

臨床緩解RA超聲下緩解組與亞臨床滑膜炎組患者人口學(xué)、實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)及疾病活動(dòng)度間無顯著差異(表1)。40個(gè)關(guān)節(jié)GS總評(píng)分在兩組患者之間也無顯著差異。亞臨床滑膜炎組患者40個(gè)關(guān)節(jié)總PD評(píng)分為2(1，4.5)，超聲下緩解組患者40個(gè)關(guān)節(jié)總PD評(píng)分為0(0，0)，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

表1 臨床緩解RA患者亞臨床滑膜炎組及超聲下緩解組人口學(xué)及臨床特征Table 1 Demographic and clinical characteristics of RA patients with ultrasound-defined subclinical synovitis and patientswith ultrasound determined remission

2.2 DEGs分析結(jié)果

本項(xiàng)目使用BGISEQ平臺(tái)一共測(cè)了10個(gè)樣本，亞臨床滑膜炎組及超聲下緩解組各5個(gè)，樣本比對(duì)基因組的平均比對(duì)率為 96.43%，比對(duì)基因集的平均比對(duì)率為67.29%；一共檢測(cè)到18 397個(gè)基因。按照|log 2 FC|>1.0及P<0.05的標(biāo)準(zhǔn)，與超聲緩解組患者對(duì)比，亞臨床滑膜炎組患者DEGs共 304個(gè)，其中106個(gè)基因上調(diào)，198 個(gè)基因下調(diào)。

2.3 PPI分析結(jié)果

從篩選出的DEGs 中，利用 STRING 平臺(tái)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖(圖1)。其中篩選連接節(jié)點(diǎn)數(shù)排序前20個(gè)樞紐基因(表2)， 包括2′-5′-寡腺苷酸合成酶(2′-5′-oligoadenylate synthetase, OAS)1、OAS2、OAS3、OASL、干擾素誘導(dǎo)蛋白(interferon-induced protein, IFI)44、IFI44L、黏液病毒/流感病毒抗性1(myxovirus resistance 1, MX1)、MMP9、干擾素誘導(dǎo)蛋白四肽重復(fù)序列(interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats, IFIT)1、IFIT2、IFIT3、ISG15泛素樣修飾劑(ISG15 ubiquitin like modifier, ISG15)、XAF1、干擾素調(diào)節(jié)因子7(interferon regulatory factor 7, IRF7)、含2個(gè)自由基的S-腺苷甲硫氨酸域(radical S-adenosyl methionine domain containing 2, RSAD2)、泛素特異性肽酶18(Ubl carboxyl-terminal hydrolase 18, USP18)、受體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(receptor-transporting protein 4, RTP4)、鳥苷酸結(jié)合蛋白1(guanylate-binding protein 1, GBP1)、CXCL10、DDX60。在RA亞臨床滑膜炎組患者的PBMC中，除MMP9為上調(diào)基因外，其余均為下調(diào)基因。

圖 1 PPI 網(wǎng)絡(luò)分析圖

表2 PPI網(wǎng)絡(luò)圖中連接點(diǎn)數(shù)排序前20個(gè)差異表達(dá)基因Table 2 Top 20 differentially expressed genes (DEGs)in PPI network

2.4 GO和KEGG富集分析結(jié)果

基于生物過程(biological process, BP)、細(xì)胞組成(cellular component, CC)、分子功能(molecular function, MF)的GO富集分析如圖2所示，與超聲下緩解組相比，亞臨床滑膜炎組PBMC顯示出多種富集，如BP類別中的免疫功能、Ⅰ型干擾素(interferon,IFN)組信號(hào)通路，CC類別中的細(xì)胞外間隙，MF類別中的絲氨酸型內(nèi)肽酶活性及OAS活性。KEGG富集結(jié)果顯示這些靶基因在抗原處理和遞呈、IL-17信號(hào)通路及自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性等通路高度富集(圖3)，且這些富集通路中的DEGs 主要影響運(yùn)輸和分解代謝過程以及細(xì)胞生長(zhǎng)和死亡過程。

圖 2 GO生物過程、細(xì)胞組成及分子功能分析

圖 3 KEGG通路富集分析差異表達(dá)基因

3 討論

在RA患者的日常臨床實(shí)踐中，主要通過患者的體格檢查及急性期反應(yīng)物等臨床指標(biāo)評(píng)估疾病活動(dòng)性[7-10]。然而，部分處于臨床緩解狀態(tài)的患者仍會(huì)出現(xiàn)疾病復(fù)發(fā)及放射學(xué)進(jìn)展[1,11]。近年來，隨著超聲技術(shù)的發(fā)展，處于臨床緩解的RA患者使用敏感的超聲檢查可發(fā)現(xiàn)臨床檢查及常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢查不容易檢測(cè)到的殘留炎癥，即亞臨床滑膜炎[12]。多項(xiàng)研究證實(shí)，超聲下亞臨床滑膜炎與疾病復(fù)發(fā)及影像學(xué)進(jìn)展密切相關(guān)[2,12]。與大多數(shù)高脂血癥或糖尿病等慢性疾病不同，RA沒有金標(biāo)準(zhǔn)的血清生物標(biāo)志物。因此，鑒定RA亞臨床滑膜炎的敏感血清生物標(biāo)志物具有很大的挑戰(zhàn)性。

本研究是第一個(gè)關(guān)于RA亞臨床滑膜炎患者PBMC轉(zhuǎn)錄組學(xué)特點(diǎn)的研究。在達(dá)臨床緩解的RA患者中初步篩選出可能與亞臨床滑膜炎發(fā)生相關(guān)的20個(gè)DEGs，其中MMP9基因在RA亞臨床滑膜炎組患者的PBMC中上調(diào)，而下調(diào)的DEGs主要為Ⅰ型IFN信號(hào)通路相關(guān)的基因。篩選出的上述DEGs主要與RA發(fā)病機(jī)制和藥物代謝有關(guān)，可能是闡明RA亞臨床滑膜炎分子發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵基因標(biāo)志。

MMP9屬于MMPs家族的明膠醇類，在滑膜被覆細(xì)胞以及滑膜下組織中浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞中表達(dá)，可以溶解明膠、Ⅰ型、Ⅴ型和Ⅹ型膠原以及粘合素，而這些成分也是關(guān)節(jié)軟骨的重要組成成分。此外，MMP9能夠激活和調(diào)節(jié)與血管新生相關(guān)的生長(zhǎng)因子。Stojanovic等[13]發(fā)現(xiàn)MMP9水平在RA患者血漿及滑液中均高于骨關(guān)節(jié)炎患者。Hakim等[14]研究顯示MMP9基因的表達(dá)水平隨DMARDs藥物治療而下降。本研究顯示相對(duì)超聲下緩解組患者，MMP9基因在RA亞臨床滑膜炎組患者的PBMC中上調(diào)，提示MMP9表達(dá)上調(diào)可能參與亞臨床滑膜炎的發(fā)生，是一個(gè)潛在的鑒別亞臨床滑膜炎的血清學(xué)標(biāo)志物。MMP9參與亞臨床滑膜炎的發(fā)生可能與其激活和調(diào)節(jié)血管新生相關(guān)的生長(zhǎng)因子等機(jī)制有關(guān)，目前尚不清楚，需要在未來的研究中進(jìn)一步闡明。

本研究發(fā)現(xiàn)在亞臨床滑膜炎組患者中，下調(diào)的DEGs大部分為Ⅰ型IFN相關(guān)的基因，主要參與Ⅰ型IFN介導(dǎo)的信號(hào)通路。IFN是細(xì)胞因子超家族，分為Ⅰ型和Ⅱ型，Ⅰ型包括IFNα和IFNβ。IFN均通過Janus激酶(JAK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和STAT通路觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而在生物學(xué)和病理學(xué)條件下發(fā)揮多種免疫功能。Ⅰ型IFN已被證明起著將先天免疫和適應(yīng)性免疫聯(lián)系在一起的信號(hào)作用，其對(duì)免疫系統(tǒng)具有雙重作用，表現(xiàn)為免疫刺激和免疫抑制功能[15]。Ⅰ型IFN在RA發(fā)病機(jī)制中的作用目前尚不清楚。van der Pouw Kraan等[16]學(xué)者曾發(fā)現(xiàn)RA患者外周血細(xì)胞的基因表達(dá)分析顯示了大量與Ⅰ型IFN活性相關(guān)的基因過表達(dá)，Ⅰ型IFN介導(dǎo)的免疫也明顯上調(diào)。而He等[17]提出Ⅰ型IFN相關(guān)基因可能是RA的特征基因，可能通過影響免疫反應(yīng)而與RA發(fā)生相關(guān)。Ⅰ型IFN相關(guān)基因還與雷公藤、TNF抑制劑、IL-6抑制劑及CD20單抗等藥物治療反應(yīng)相關(guān)，其表達(dá)水平的變化對(duì)不同藥物治療有所區(qū)別[5,18-20]。另外，Ⅰ型IFN與TNF-α之間存在交叉調(diào)節(jié)。IFNβ在體外以及關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型體內(nèi)均可下調(diào)TNF-α生成[21-22]。相反，TNF-α在體外抑制漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-β，在系統(tǒng)性幼年關(guān)節(jié)炎患者及干燥綜合征患者體內(nèi)TNF-α的阻斷可導(dǎo)致Ⅰ型IFN通路激活增加[23-24]?？傊?，先前研究的結(jié)果表明Ⅰ型IFN相關(guān)基因可能是RA特征基因，可能通過影響免疫反應(yīng)而與RA的發(fā)展相關(guān)。根據(jù)其免疫雙重作用，它們?cè)赗A的作用可能有弊或有利。既往研究顯示在RA患者的滑膜組織中可以檢測(cè)到IFNβ蛋白，其中FLS是導(dǎo)致RA滑膜中IFNβ水平升高的原因[25-26]。另外，有學(xué)者提出RA滑膜中炎性細(xì)胞可能是從預(yù)先激活的外周細(xì)胞中募集的，而不是或不僅是通過局部產(chǎn)生[27]。因此，外周血PBMC中Ⅰ型IFN表達(dá)水平可反應(yīng)局部滑膜組織中的表達(dá)水平。本研究Ⅰ型IFN相關(guān)的基因在超聲下緩解組PBMC中相對(duì)上調(diào)可能暗示Ⅰ型IFN在RA中主要起到抗炎作用，亦或者由于Ⅰ型IFN高水平患者滑膜增殖主要以炎癥活動(dòng)為主，使其對(duì)藥物治療反應(yīng)好，滑膜炎可很快消退，這值得進(jìn)一步探討。

此外，亞臨床滑膜炎組患者下調(diào)的DEGs還包括CXCL10。CXCL10由IFN-γ刺激后分泌產(chǎn)生，具有強(qiáng)大的招募中性粒細(xì)胞、促進(jìn)細(xì)胞因子分泌的功能，可介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，通常在RA患者外周血及滑膜組織表達(dá)增高[28]。然而，CXCL10在RA整個(gè)病程中是否持續(xù)發(fā)揮作用及其與RA疾病活動(dòng)度及骨破壞等之間的關(guān)系目前尚未闡明。有研究發(fā)現(xiàn)，CXCL10在部分RA患者的滑液和滑膜組織中水平很高，但血清中幾乎檢測(cè)不到CXCL10[29]。Kraan等[30]研究顯示，RA患者滑膜組織中CXCL10在臨床受累及臨床未受累關(guān)節(jié)中的表達(dá)無明顯差異，表明CXCL10水平與RA臨床活動(dòng)性可能無明顯相關(guān)。Strieter等[31]體外和體內(nèi)研究均顯示，CXCL10是一種血管生成抑制劑, 其作用機(jī)制可能與清除一些其他的生長(zhǎng)因子, 如IL-8和bFGF等有關(guān)。提示在本研究中CXCL10基因水平下調(diào)與亞臨床滑膜炎發(fā)生有關(guān)可能是由于其對(duì)血管形成相關(guān)因子的抑制作用下降有關(guān)，值得進(jìn)一步深入研究。

本研究存在一些局限性：第一，本研究納入的樣本量小，兩組人群性別、年齡等基本信息存在一定差異，可能導(dǎo)致偏倚。第二，兩組人群均為RA達(dá)臨床緩解的患者，目前疾病均處于相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)。部分超聲下緩解組患者仍有輕度滑膜增生，使得兩組患者之間差異較小。第三，本研究采用全外周血單個(gè)核細(xì)胞，未區(qū)分細(xì)胞群。白細(xì)胞亞群的動(dòng)態(tài)變化也可能會(huì)混淆結(jié)果[32]。第四，本研究為初步探索性研究，僅研究了亞臨床滑膜炎相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)，而mRNA水平未必能代表蛋白水平，本研究結(jié)果有待在基因及蛋白水平上進(jìn)一步驗(yàn)證。另外，由于RA亞臨床滑膜炎患者的滑膜組織及滑液不容易獲取，本研究?jī)H對(duì)患者PBMC進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。未來將收集患者滑膜組織及滑液進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)檢測(cè)。第五，本研究?jī)H納入臨床及超聲均緩解的RA患者作為對(duì)照，缺乏健康人群及活動(dòng)期RA患者作為對(duì)照，未來研究將納入這兩組人群作為對(duì)照組進(jìn)行驗(yàn)證，探索特異于RA亞臨床滑膜炎患者的血清學(xué)標(biāo)志物。

綜上所述，在RA達(dá)臨床緩解的患者，外周血MMP9升高以及Ⅰ型干擾素相關(guān)通路、CXCL10下調(diào)可能提示亞臨床滑膜炎存在的潛在生物學(xué)標(biāo)志物，或許可以為揭示亞臨床滑膜炎的發(fā)生提供新的視角和潛在的新靶點(diǎn)。但其分子發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚，仍需在基因及蛋白水平進(jìn)一步驗(yàn)證，并深入探索。