郁帆, 馮瑩, 韓劍,2, 盛強(qiáng), 孫麗英, 羅明,2*

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.新疆維吾爾自治區(qū)高校農(nóng)林有害生物監(jiān)測與安全防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830052；3.新疆巴音郭勒蒙古自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，新疆 庫爾勒 841003；4.西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

庫爾勒香梨(簡稱香梨)(Pyrussinkiangensi)是一個地域性極強(qiáng)的地方特色品種，主要分布在新疆巴州庫爾勒和阿克蘇地區(qū)，是新疆林果產(chǎn)業(yè)的重要組成部分。隨著香梨產(chǎn)業(yè)的發(fā)展、種植規(guī)模的擴(kuò)大和栽培模式的改變，多種病害相繼發(fā)生，成為影響香梨生產(chǎn)的突出問題[1]。由梨黑腐皮殼菌(Valsapyri)引起的梨樹腐爛病是梨樹栽培生產(chǎn)中最重要的真菌病害之一，在國內(nèi)梨主產(chǎn)區(qū)均有分布，尤其在香梨上危害最為普遍且嚴(yán)重，重病園病株率高達(dá)77.8%～100%[2]。在梨樹結(jié)果期持續(xù)低溫、凍害或夏季高溫、干燥及管理不當(dāng)?shù)葘?dǎo)致樹勢衰弱會加重病害發(fā)生，造成樹皮腐爛、枝干潰瘍或干枯、大量果樹死亡甚至毀園。隨著樹齡的增加，腐爛病逐年加重，嚴(yán)重威脅香梨產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[3]。

梨樹腐爛病主要通過刮除病斑、噴施或涂抹化學(xué)農(nóng)藥進(jìn)行防治。目前國內(nèi)尚無防治梨樹腐爛病的專用藥劑，生產(chǎn)上常用石硫合劑、腐植酸銅、甲基硫菌靈和甲硫萘乙酸等化學(xué)藥劑進(jìn)行防治，但使用后病斑復(fù)發(fā)率仍達(dá)20%～30%，病害難以根除[4]。當(dāng)前生產(chǎn)中農(nóng)藥使用次數(shù)增多，亂施濫用問題突出，不可避免地造成病原菌抗藥性增加、果品農(nóng)藥殘留超標(biāo)和環(huán)境污染等一系列問題，因此，生物防治是現(xiàn)代林果生產(chǎn)發(fā)展的必然選擇。發(fā)掘?qū)Σ≡哂幸志饔玫挠幸嫖⑸?，利用其活體及其活性物質(zhì)研制成生物菌劑防治植物病害，選擇性強(qiáng)且病原菌不易產(chǎn)生抗藥性，具有安全高效、環(huán)境友好等突出優(yōu)勢。利用生防菌防治果樹腐爛病國內(nèi)外開展了一些研究，但多數(shù)研究圍繞著蘋果腐爛病的防控展開，集中于從果樹和藥用植物內(nèi)生菌、果樹根際和果園土壤微生物中篩選腐爛病病原菌的拮抗菌，如婁徹氏鏈霉菌(Streptomycesrochei)、埃及青霉(Penicilliumegyptiacum)[5]、螺旋毛殼(Chaetomiumspirale)[6]、極長鏈霉菌(Streptomyceslongissimus)[7]、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)[8]、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)[9]等，在抗菌機(jī)理、拮抗菌發(fā)酵條件優(yōu)化、室內(nèi)毒力和田間防效試驗(yàn)等方面取得了一定研究成果[10]。但有關(guān)梨樹腐爛病的生物防治研究鮮見報(bào)道。

農(nóng)用植物酵素是利用蔬菜、藥用植物、水果、果皮、果渣和農(nóng)業(yè)廢棄物等多種植物源材料為主要原料加入糖(蜜)和水，經(jīng)天然發(fā)酵或接種菌劑發(fā)酵制成的微生物制品。酵素發(fā)酵技術(shù)于20世紀(jì)90年代由日本引入我國。在種植業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用實(shí)踐表明，農(nóng)用植物酵素將有機(jī)廢棄物資源化利用，且制作簡單、成本低廉、安全環(huán)保，在農(nóng)作物、蔬菜、果樹上葉噴或根施具有活化植物營養(yǎng)、改良土壤結(jié)構(gòu)、促進(jìn)植物生長、提高產(chǎn)量、改善品質(zhì)等突出功效，展現(xiàn)了其良好的應(yīng)用價(jià)值與推廣前景[11]。近年來，酵素液對植物病蟲害的生物防治作用得到人們的關(guān)注。酵素液中的抗菌活性成分對植物土傳病害和葉面病原菌具有明顯的抑制作用，可顯著提高作物抗病害能力[12]，表現(xiàn)出良好的應(yīng)用潛力。本研究針對梨黑腐皮殼菌，以前期從各種農(nóng)用植物酵素液中分離出的酵素細(xì)菌為材料，從中篩選具有較強(qiáng)抑菌活性的拮抗菌株，明確其抑菌作用方式，測定其防病效果，為發(fā)掘生防資源、安全防控梨樹腐爛病提供科學(xué)基礎(chǔ)，對于促進(jìn)梨產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1酵素液細(xì)菌 本課題組在前期研究中從新疆庫爾勒市阿瓦提鄉(xiāng)、哈拉玉宮鄉(xiāng)等地采集農(nóng)戶以各種果蔬、中草藥植物(香梨、蘋果、西瓜、甜瓜、甘草、蒲公英、香蔥、大蔥等)為原料自制的酵素發(fā)酵液，采用稀釋平板分離法從中分離、純化出68個細(xì)菌菌株。

1.1.2病原菌 梨黑腐皮殼菌(Valsapyri)菌株XJ005由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與園藝學(xué)院林木病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室從庫爾勒香梨腐爛病病樣中分離、鑒定并保存，經(jīng)測定為強(qiáng)致病力菌株。

1.1.3培養(yǎng)基 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(NA)、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(NB)、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)。

1.2 梨黑腐皮殼菌拮抗菌株篩選

1.2.1拮抗菌的初篩 采用平板對峙培養(yǎng)法進(jìn)行拮抗菌的初篩。將活化好的梨黑腐皮殼菌接種于PDA平板，25 ℃恒溫培養(yǎng)5 d后用滅菌打孔器沿菌落邊緣取直徑約6 mm的菌餅，接種在PDA平板(直徑90 mm)中央，再將待篩選的細(xì)菌菌株點(diǎn)接于距平板邊緣20 mm處等距離的上、下、左、右4個位置，以只接種梨黑腐皮殼菌的平板作為對照，每菌株重復(fù)測定3皿，置于25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待對照組菌落長滿平板，觀察并記錄有無抑菌圈產(chǎn)生并用十字交叉法測量處理病原菌菌落直徑，計(jì)算抑菌率。試驗(yàn)重復(fù)3次，初篩出對梨黑腐皮殼菌有明顯拮抗作用的細(xì)菌菌株。

1.2.2拮抗菌的復(fù)篩 ①拮抗菌發(fā)酵液的制備：將初篩拮抗菌株在NA平板上活化后，用接種環(huán)移取一環(huán)接入裝有50 mL NB培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中，150 r·min-1、28 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)1～2 d，至細(xì)菌發(fā)酵液OD600為0.8～1.0。

②發(fā)酵液抑菌作用測定：濾紙片法。在PDA平板中央接種直徑為6 mm的病菌菌餅，在距培養(yǎng)皿邊緣20 mm處上、下、左、右4個位置放置直徑為5 mm的滅菌濾紙片，每紙片滴加5 μL初篩拮抗菌的發(fā)酵液，以加入5 μL NB培養(yǎng)液的處理作為對照，每處理重復(fù)3皿，25 ℃暗培養(yǎng)3 d后十字交叉法測量病原菌菌落直徑(mm)，計(jì)算抑菌率。

抑菌率=[(對照病原菌菌落直徑-處理病原菌直徑)/(對照病原菌直徑-6)]×100%

(1)

③除菌發(fā)酵濾液的抑菌作用測定：牛津杯法。將初篩拮抗菌株發(fā)酵液在4 ℃條件下10 000 r·min-1離心20 min，收集上清液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，得到除菌發(fā)酵濾液。抑菌作用的測定用濾紙片法。

1.3 梨黑腐皮殼菌孢子萌發(fā)率測定

1.3.1梨黑腐皮殼菌孢子萌發(fā)率測定 在香梨果園采集腐爛病發(fā)病枝條，切取帶有梨黑腐皮殼菌分生孢子器的樹皮組織保濕，待分生孢子角溢出后，以香梨果實(shí)煎汁為培養(yǎng)液，制備成濃度為106個·mL-1的孢子懸浮液。將拮抗菌發(fā)酵液或除菌發(fā)酵濾液與孢子懸浮液各取25 μL滴在載玻片中央，并置于裝有1%水瓊脂的培養(yǎng)皿中密封，以滅菌培養(yǎng)基與孢子懸浮液混合為對照，每處理3個重復(fù)。25 ℃恒溫保濕，分別于12、24和36 h后顯微鏡下觀察記錄孢子萌發(fā)情況，計(jì)算孢子萌發(fā)抑制率。

孢子萌發(fā)抑制率=[(對照孢子萌發(fā)率-處理孢子萌發(fā)率)/(對照孢子萌發(fā)率)]×100%

(2)

1.3.2梨黑腐皮殼菌菌絲生長觀察 將活化的梨黑腐皮殼菌菌餅接種于PDA平板中央，拮抗菌株點(diǎn)接于四周，25 ℃恒溫對峙暗培養(yǎng)，以未接種拮抗菌的梨黑腐皮殼菌菌絲作為對照。觀察拮抗菌菌落和梨黑腐皮殼菌菌落之間產(chǎn)生的抑菌帶，5 d后挑取抑菌圈邊緣的梨黑腐皮殼菌菌絲，在光學(xué)顯微鏡(LWD300-38LFT)下觀察其形態(tài)變化并拍照。

1.4 離體枝條法測定拮抗菌株對腐爛病的防效

在庫爾勒市香梨果園采集香梨樹當(dāng)年生枝條，剪取粗細(xì)一致、長30 cm的枝段，無菌水沖洗三次后用75%乙醇溶液浸泡5 min，晾干，兩端封蠟防止水分散失。用手術(shù)刀切出直徑為5 mm的圓形傷口，取一小塊(約1 cm2)滅菌的脫脂棉蘸取1 mL拮抗菌發(fā)酵液(OD600=0.8～1.0)或不同稀釋倍數(shù)的除菌發(fā)酵濾液貼在傷口部位，用保鮮膜包裹保濕，24 h后再接種新鮮培養(yǎng)的梨黑腐皮殼菌菌餅(Ф=5 mm)1塊，每個枝條2個接種點(diǎn)，重復(fù)5個枝條。同法設(shè)置先用滅菌的脫脂棉蘸取1 mL無菌培養(yǎng)基貼敷枝條傷口，保濕24 h后再接種梨黑腐皮殼菌菌餅的處理為對照。將處理后的枝條放置在塑料托盤中，盤底鋪有加無菌水的滅菌吸水紙，盤口覆蓋保鮮膜保濕，于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察記錄腐爛病的發(fā)生情況。7 d后測量病斑大小并按照公式計(jì)算病斑面積，統(tǒng)計(jì)防治效果。

病斑面積=π×病斑長邊半徑×病斑短邊半徑

(3)

防治效果=[(對照病斑面積-處理病斑面積)/對照病斑面積]×100%

(4)

1.5 拮抗菌株的鑒定

1.5.1形態(tài)及生理生化特征鑒定 參照《常用細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[13]和《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[14]進(jìn)行形態(tài)及生理生化特征測定。將拮抗菌株劃線接種于NA培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)24 h，觀察并描述菌落形態(tài)特征。革蘭氏染色觀察菌體形態(tài)及染色反應(yīng)；芽孢染色觀察芽孢形狀及著生位置。采用北京陸橋技術(shù)股份有限公司的微量生化鑒定管測定菌株的VP、MR、H2S、硝酸鹽還原、葡萄糖產(chǎn)氣、接觸酶、氧化酶、淀粉水解、明膠液化、丙二酸鹽、吲哚試驗(yàn)反應(yīng)及對乳糖、木糖、果糖和甘露糖等碳源的利用。

1.5.216S rRNA和gyrA基因序列測定及系統(tǒng)樹發(fā)育分析 以細(xì)菌基因組柱式提取試劑盒(天根)提取的基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，16S rRNA的上、下游引物分別為27F：5′-AGAGTTTGATCCTG-GCTCAG-3′和1492R：5′-CTACGGCTACCTTG-TTACGA-3′，gyrA基因的上、下游引物分別為F：5′-CAGTCAGGAAATGCGTACGTCCTT-3′和R：5′-CAAGGTAATGCTCCAGGCATTGCT-3′。PCR反應(yīng)體系為50 μL：模板DNA、Taq聚合酶和dNTPs各1 μL，上、下游引物各1.5 μL，10×Buffer 5 μL，ddH2O 39 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35個循環(huán)；72 ℃終延伸7 min。PCR產(chǎn)物用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收，回收產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠檢測后提交上海生工生物工程有限公司完成測序。測序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行同源性比對，利用MEGA 5.05軟件以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 農(nóng)用植物酵素液細(xì)菌對梨黑腐皮殼菌的抑菌作用

通過平板對峙，從分離于各種植物酵素液的68株細(xì)菌中初篩出15株對梨黑腐皮殼菌具有拮抗作用的菌株，抑菌率為41.25%～74.14%(表1)。

表1 農(nóng)用植物酵素液細(xì)菌對梨黑腐皮殼菌抑菌作用初篩結(jié)果

其中，gjfn2、gjfn4、PFN41、PFN30、PGY-FX65、X2FN25和YC-FX74具有較強(qiáng)的抑菌作用，抑菌率在70%以上。gjfn4的抑菌效果如圖1所示。

A：菌體與Valsa pyri對峙培養(yǎng)；B：發(fā)酵液與Valsa pyri對峙培養(yǎng)；C：除菌發(fā)酵濾液與Valsa pyri對峙培養(yǎng)；D：正常生長的梨黑腐皮殼菌

通過濾紙片法、牛津杯法測定初篩菌株發(fā)酵液和發(fā)酵除菌濾液的抑菌作用，對拮抗菌株進(jìn)行復(fù)篩，gjfn2、gjfn4、PFN41和PGY-FX67抑菌作用顯著，發(fā)酵液和發(fā)酵除菌濾液的抑菌率均分別大于70%和60%，顯著高于其他11個菌株(表2)。因此,選取gjfn2、gjfn4、PFN41和PGY-FX67做進(jìn)一步研究。

表2 農(nóng)用植物酵素液細(xì)菌對梨黑腐皮殼菌抑菌作用的復(fù)篩

2.2 拮抗菌對梨黑腐皮殼菌分生孢子萌發(fā)和菌絲生長的抑制作用

2.2.1對分生孢子萌發(fā)的抑制作用 測定gjfn2、gjfn4、PFN41和PGY-FX67發(fā)酵液和除菌發(fā)酵濾液對梨黑腐皮殼菌分生孢子萌發(fā)的抑制作用，結(jié)果(表3)表明，4個拮抗菌株發(fā)酵液和除菌發(fā)酵濾液對梨黑腐皮殼菌分生孢子的萌發(fā)有明顯的抑制作用，可顯著降低梨黑腐皮殼菌分生孢子的萌發(fā)率。其中，gjfn4和PFN41對梨黑腐皮殼菌分生孢子的抑制作用最為顯著，在發(fā)酵液和除菌發(fā)酵濾液中36 h分生孢子不能萌發(fā)，抑制率均達(dá)到100%。

表3 拮抗菌株發(fā)酵液和除菌發(fā)酵濾液對梨黑腐皮殼菌分生孢子萌發(fā)的抑制效果

2.2.2拮抗菌株對梨黑腐皮殼菌絲生長的抑制作用 將拮抗菌株gjfn4與梨黑腐皮殼菌對峙培養(yǎng)5 d后顯微觀察(圖2)顯示，對照梨黑腐皮殼菌菌絲生長正常，菌絲較細(xì)、均勻一致、表面光滑、平直；而受gjfn4抑制的梨黑腐皮殼菌菌絲生長異常，如菌絲加粗、顏色變深、不規(guī)則彎曲增多、分枝增加、節(jié)間短、頂端膨大、畸形、部分膨大細(xì)胞破裂、細(xì)胞質(zhì)外滲等。

A：正常菌絲；B～C：gjfn4作用后的畸形菌絲

2.3 拮抗細(xì)菌對梨樹腐爛病防治效果

采用離體枝條法測定拮抗菌株gjfn2、gjfn4、PFN41和PGY-FX67發(fā)酵液和除菌發(fā)酵濾液對梨樹腐爛病的防效，結(jié)果(表4)表明，未接種拮抗菌的對照在接種梨黑腐皮殼菌1～2 d后枝條上出現(xiàn)典型病斑，并迅速擴(kuò)展；而噴施gjfn2、gjfn4、PFN41、PGY-FX67發(fā)酵液和除菌發(fā)酵濾液后再接種病原菌的處理能有效抑制病斑的擴(kuò)展速度、減緩顯癥時間(3 d后)，且病斑面積均顯著低于對照。4個菌株發(fā)酵液的防效均達(dá)到79%以上，除菌發(fā)酵濾液原液防效均達(dá)73%以上，發(fā)酵液防效略高于除菌發(fā)酵濾液。4個菌株中，gjfn4菌株發(fā)酵液、除菌發(fā)酵濾液原液和除菌發(fā)酵濾液50倍稀釋液的防效分別為84.79%、81.57%和67.27%，防效最佳。

表4 拮抗細(xì)菌對梨樹腐爛病的離體枝條防效

2.4 拮抗菌株的鑒定

2.4.1形態(tài)特征及生理生化特性 對拮抗菌株gjfn2、gjfn4、PFN41、PGY-FX67的形態(tài)特征、生理生化特性進(jìn)行觀察測定，結(jié)果(表5)表明，4個菌株在菌落、菌體形態(tài)和生理生化特性上均符合芽孢桿菌屬特征。gjfn2、gjfn4和PFN41菌株在NA培養(yǎng)基上菌落均呈圓形、乳白色，表面粗造、邊緣不規(guī)則，菌體桿狀，G+，芽孢中央位；在VP、甲基紅、H2S、革蘭氏染色、硝酸鹽還原、葡萄糖產(chǎn)氣、接觸酶、淀粉水解、明膠液化、丙二酸鹽、吲哚試驗(yàn)中均呈陽性反應(yīng)；氧化酶、乳糖、木糖、甘露糖試驗(yàn)中均呈陰性反應(yīng)；其特性與貝萊斯芽孢桿菌(B.velezensis)一致。PFN41在NA培養(yǎng)基上菌落稍隆起、芽孢囊彭大，甲基紅、H2S、丙二酸鹽試驗(yàn)呈陰性反應(yīng)，氧化酶試驗(yàn)呈陽性反應(yīng)，其特性與解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)一致。

表5 拮抗菌株的形態(tài)和生理生化特性

2.4.216S rRNA和gyrA基因序列分析 以菌株gjfn2、gjfn4、PFN41和PGY-FX67的總DNA為模板進(jìn)行16S rRNA的PCR擴(kuò)增，均得到一條大小約為1 500 bp的條帶，經(jīng)測定序列全長分別為1 438、1 438、1 440和1 438 bp，GenBank登錄號分別為MW255029、MW255046、MW255043和MW266937。將測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中與已知序列進(jìn)行BLAST比對，并下載與其相近序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果(圖3)表明，菌株P(guān)GY-FX67、PFN41和gjfn4聚為一類，同時又和gjfn2、貝萊斯芽孢桿菌C1聚在一個分支，與貝萊斯芽孢桿菌模式菌株NRRL B-41580T相似性最高，達(dá)99.8%～99.9%。

圖3 基于16S rRNA構(gòu)建的4個拮抗菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

貝萊斯芽孢桿菌與枯草芽孢桿菌枯草亞種(B.subtilissubsp.subtilis)、解淀粉芽孢桿菌為相近種，序列相似性高于物種劃分推薦的閾值(98.65%)。因此，僅通過16S rRNA基因序列分析不能有效區(qū)分。進(jìn)一步對供試菌株的持家基因gyrA進(jìn)行擴(kuò)增，分別獲得了1 000 bp左右的特異性目標(biāo)條帶，提交GenBank獲得登錄號分別為MW316629、MW316630、MW316631、MW316632。系統(tǒng)發(fā)育分析(圖4)顯示，gjfn2、PGY-FX67菌株與B.velezensisONU 553(CP043416)的序列相似性達(dá)100%；gjfn4菌株與貝萊斯芽孢桿菌B.velezensisCBMB205(NZ_CP011937)的序列相似性達(dá)到100%；PFN41號菌株與解淀粉芽孢桿菌B.amyloliquefaciensPG12(KC797584)的序列相似性達(dá)到100%。綜合培養(yǎng)性狀、形態(tài)及生理生化特征，將gjfn2、gjfn4、PGY-FX67鑒定為貝萊斯芽孢桿菌，PFN41鑒定為解淀粉芽孢桿菌。

圖4 基于gyrA基因構(gòu)建的4個拮抗菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 討論

酵素液發(fā)酵過程中有豐富的復(fù)合菌群參與，產(chǎn)生多種營養(yǎng)及有機(jī)酸、酚類、活性酶、生物表面活性劑等活性物質(zhì)[15]，具有改善植物營養(yǎng)和抗菌殺蟲的功效。近期，本課題組從西、甜瓜酵素液細(xì)菌中分離到XG-FX22和G-FX12菌株，對梨腐爛病的防效顯著高于內(nèi)生細(xì)菌[16]，由此表明，酵素液是獲得高效拮抗菌的重要來源。本研究從新疆庫爾勒果農(nóng)利用各種果蔬原料經(jīng)天然發(fā)酵制備的酵素液中分離的68株細(xì)菌中，采用平板對峙試驗(yàn)初篩選出了15株對梨黑腐皮殼菌具有拮抗作用的菌株，篩選概率達(dá)22.1%；抑菌率為41.25%～74.14%，其中有7個菌株的抑菌率大于70%。通過發(fā)酵液和除菌發(fā)酵濾液復(fù)篩出4株抑菌效果顯著的菌株，通過香梨離體枝條測定其防病效果，結(jié)果表明，4個菌株的發(fā)酵液防效均達(dá)到79%以上，除菌發(fā)酵濾液防效均達(dá)到73%以上。其中g(shù)jfn4菌株的發(fā)酵液和除菌發(fā)酵濾液防效俱佳，均達(dá)到80%以上，且除菌發(fā)酵濾液50倍稀釋液的防效仍能保持在60%以上，具有作為香梨腐爛病生防菌的良好潛力。本研究結(jié)果再次證實(shí)了在酵素液中存在有大量的拮抗菌株，是獲得高抗菌活性菌株的新來源。

近年來，農(nóng)用植物酵素液在抑制病原菌生長、增強(qiáng)植物抗病性方面的功效不斷地被研究發(fā)現(xiàn)和認(rèn)知。耿健等[17]利用芳香植物孔雀草、薄荷發(fā)酵制成的酵素液噴施梨樹，能有效防治梨黑心病、腐爛病和輪紋病的發(fā)生，對梨樹葉片生長、光合特性和果實(shí)品質(zhì)均具有促進(jìn)作用。黃偉菁等[18]證實(shí)噴施蘋果幼果酵素液能夠明顯促進(jìn)樹體生長，改善果實(shí)品質(zhì)，減少α-法呢烯的含量，降低蘋果虎皮病的發(fā)生率。王榮娟等[19]發(fā)現(xiàn)在蘋果樹上噴施蘋果果實(shí)酵素液，可提高活性氧含量和抗氧化酶活性，有效誘導(dǎo)蘋果葉片對斑點(diǎn)落葉病的抗性。但在應(yīng)用植物酵素過程中也發(fā)現(xiàn)，由于原料成分多樣、參與天然發(fā)酵的菌種復(fù)雜、易污染有害雜菌、復(fù)合菌群發(fā)酵過程易受環(huán)境影響、代謝產(chǎn)物難以控制等因素而造成酵素質(zhì)量良莠不齊、使用效果不穩(wěn)定等問題[20-21]。制作植物酵素液是一個復(fù)雜的發(fā)酵過程，在多種菌種復(fù)合共同作用下，使發(fā)酵基質(zhì)產(chǎn)生一系列的生物化學(xué)變化，形成抗氧化物、有機(jī)酸、酶類和次生代謝產(chǎn)物等抗菌成分。由于發(fā)酵菌種不同、原料不同、工藝不同，所以發(fā)酵過程中相關(guān)代謝產(chǎn)物的變化也不盡相同，但參與發(fā)酵的菌種與酵素液的生防功能密不可分。因此，從酵素液中篩選出抗菌功能菌株，對于明確其功能性成分和發(fā)酵機(jī)理、產(chǎn)品質(zhì)量調(diào)控及開發(fā)利用都具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，自然發(fā)酵的植物酵素液中分離出的菌種通常是酵母菌和醋酸菌、乳酸菌等[22]。朱會霞等[23]通過高通量測序檢測水果酵素發(fā)酵過程中的細(xì)菌變化，發(fā)現(xiàn)正常發(fā)酵主要的細(xì)菌有醋酸桿菌、乳酸桿菌、芽孢桿菌、酸硫桿狀菌、明串珠菌和嗜酸菌。本研究從酵素液分離細(xì)菌中篩選出的4株梨腐爛病生防潛力菌株均為芽孢桿菌屬，經(jīng)鑒定gjfn2、gjfn4、PGY-FX67為貝萊斯芽孢桿菌，PFN41為解淀粉芽孢桿菌。這可能是由于芽孢桿菌廣泛棲息于植物體表、體內(nèi)和空氣、水等環(huán)境中，在酵素液發(fā)酵過程中生長快，抗逆性強(qiáng)，耐受高酸、高滲透壓環(huán)境，能產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，因而在發(fā)酵過程中與有害菌的競爭中更具優(yōu)勢。貝萊斯芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌是目前備受關(guān)注的重要生防細(xì)菌，具有對多種植物病原菌的抗菌活性及促進(jìn)植物生長的作用[24-25]，但對梨腐爛病防治作用研究尚未見報(bào)道。

拮抗菌株對梨黑腐皮殼菌的抑制作用研究表明，4個拮抗菌株的發(fā)酵液和除菌發(fā)酵濾液可顯著降低梨黑腐皮殼菌分生孢子的萌發(fā)率。顯微觀察顯示，拮抗菌造成梨黑腐皮殼菌菌絲加粗、不規(guī)則彎曲增加、頂端膨大畸形及細(xì)胞原生質(zhì)外滲。離體防效試驗(yàn)結(jié)果表明，拮抗菌株的發(fā)酵液和發(fā)酵除菌濾液對香梨腐爛病的防效接近，說明其代謝產(chǎn)物在防病過程中起重要作用。呂前前等[26]研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌菌株BaA-007對蘋果腐爛病菌的作用機(jī)制是分泌次生代謝物和激活JA、SA、ET和細(xì)胞壁相關(guān)抗性反應(yīng)抑制腐爛病斑擴(kuò)展。程超[27]從產(chǎn)酶溶桿菌(L.enzymogenes)OH11次生代謝產(chǎn)物中分離的HSAF(heat stable antifungal factor)對梨黑腐皮殼菌有較強(qiáng)的生長抑制作用，EC50值為0.5 μg·mL-1。利用微生物次生代謝物開發(fā)生物農(nóng)藥，可實(shí)現(xiàn)規(guī)模化生產(chǎn)，耐貯性好，功效穩(wěn)定，對防控植物病害更具應(yīng)用價(jià)值和發(fā)展前景。本研究從植物酵素液中篩選獲得的梨腐爛病生防潛力菌株，其田間防效是否理想有待進(jìn)一步驗(yàn)證。同時，菌株的抑菌機(jī)制及抑菌物質(zhì)的成分、結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定性等都需在今后工作中進(jìn)行更加深入的研究。