張卓然， 楊柳， 王東歧， 荊玉玲， 王巍，郭榮君*， 肖能武， 向世標， 李世東

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所，北京100193; 2.湖北省十堰市農(nóng)業(yè)科學院，湖北 十堰 442000)

魔芋(Amorphaphalluskonjac)為多年生草本植物，屬于天南星科魔芋屬，喜溫暖潮濕和蔭蔽的環(huán)境，主要分布在東南亞和非洲[1]。我國主要在湖南、湖北、云南、四川及陜西等地栽培。魔芋在整個生長期和貯藏期都可能出現(xiàn)腐爛病，感染后塊莖及其莖葉變軟、腐爛，葉片變黃，莖稈易彎曲，植株倒伏。球莖染病，表皮出現(xiàn)水漬暗褐色病斑，隨后逐漸擴大向內(nèi)擴展，果肉粘稠變軟呈黑褐色[2-4]。魔芋一般在6月下旬開始發(fā)病，7、8月由于高溫多雨，空氣和土壤濕度高，是魔芋軟腐病發(fā)生的高峰期，9月隨氣溫下降發(fā)病率也逐漸降低[5]。魔芋軟腐病是一種細菌性病害，主要由胡蘿卜軟腐果膠桿菌胡蘿卜軟腐亞種(Pectobacteriumcarotovorasubsp.carotovora)引起[6]。生產(chǎn)上報道白絹病菌也可導致魔芋腐爛[7]。吳金平[8]還分離到一株腸桿菌科細菌，也會導致魔芋軟腐。

湖北十堰市位于亞熱帶濕潤季風氣候區(qū)，是理想的魔芋種植地[9]，從低山平原到高山都有魔芋生長。隨著魔芋產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，魔芋種植面積逐漸擴大，規(guī)?；俺Ｄ赀B作導致魔芋腐爛病發(fā)生加重、傳播快、防治難，嚴重制約魔芋產(chǎn)業(yè)發(fā)展[10]。生產(chǎn)上需采用的曬種、種芋處理等技術雖然可緩解魔芋腐爛病的發(fā)生，但魔芋發(fā)病仍然很重。調(diào)查發(fā)現(xiàn),十堰市魔芋腐爛病除軟腐型外[6]，還存在其他病原引起的腐爛。明確十堰市不同地區(qū)魔芋腐爛病的發(fā)病類型和主要致病菌對該病害的防控具有重要的指導意義。

項目組對十堰市部分地點魔芋地塊的耕作措施、種植環(huán)境進行了調(diào)查，采集生長期不同發(fā)病癥狀的魔芋進行病原菌的分離，并根據(jù)細菌的16S rRNA基因序列分析結果對菌株進行初步鑒定，發(fā)現(xiàn)分離到的魔芋腐爛病菌與樣品來源和樣品的發(fā)病類型密切相關，研究結果為魔芋腐爛病的防控提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1培養(yǎng)基 1/2 King′S B培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g、甘油5.0 g、磷酸氫二鉀0.75 g、硫酸鎂0.75 g、瓊脂18.0 g、蒸餾水1 L，pH 7.2。

1/2 PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯100.0 g、葡萄糖10.0 g、瓊脂18.0 g、蒸餾水1 L。

加抗1/2 PDA培養(yǎng)基：在1/2 PDA培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素鈉，濃度為50 μg·mL-1。

LB培養(yǎng)液：胰蛋白胨10.0 g、酵母提取物5.0 g、氯化鈉5.0 g、蒸餾水1 L，pH 7.0。

磷酸緩沖液：KH2PO41.0 g、(NH4)2SO41.0 g，去離子水定容至1 000 mL，pH 5.5。

1.1.2試劑 1%～2%次氯酸鈉溶液、30%甘油用純甘油配制；溶菌酶購自北京大宏利輝生物科技中心；1.1×T3 Super PCR Mix購自北京擎科生物科技有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒(DP302-02)購自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 樣品采集

于7月16日—19日魔芋發(fā)病初期，調(diào)查了十堰市柳陂、譚家灣、周家洼、鄖西鄉(xiāng)四個地點的魔芋發(fā)病情況，采集發(fā)病植株，記錄其發(fā)病癥狀、前茬作物、種芋品種、栽培措施以及發(fā)病率等。另取部分種芋種植于中國農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所(植保所)盆栽沙土中，于7月26日—8月7日采集發(fā)病植株。病樣相關信息列于表1。

表1 發(fā)病魔芋樣品采集

1.3 病原菌的分離和純化

1.3.1莖稈汁液涂抹法 莖稈表面用1%～2%的次氯酸鈉溶液沖洗30 s，再用無菌水沖洗3次，濾紙吸干水分，刮除表皮，從切開的橫截面擠出汁液，涂抹于1/2 King′S B平板上，28 ℃培養(yǎng)3 d。三區(qū)劃線法純化細菌，肉眼觀察單菌落形態(tài)并記錄。

1.3.2組織塊分離法 取病健交界處的莖桿組織或者塊莖組織，在1%～2%的次氯酸鈉溶液中浸泡30～90 s，無菌水漂洗3次共2 min，濾紙吸干水分。將部分組織塊在1/2 King′S B平板上涂抹，28 ℃培養(yǎng)3 d；部分組織塊放置于加抗的1/2 PDA平板上，26 ℃培養(yǎng)3～4 d。經(jīng)劃線純化后，觀察單菌落形態(tài)。菌株經(jīng)劃線純化后，保存于30%甘油中，貯存于-20 ℃。切取1/2 PDA平板上生長的真菌邊緣菌絲轉接于加抗1/2 PDA平板上，純化后保存于30%甘油中，貯存于-20 ℃。

1.3.3不同地點病原菌的分離頻率統(tǒng)計 根據(jù)單菌落的顏色、形狀、透明度、光滑度、色素、大小等特征進行分類歸納，統(tǒng)計有效菌株。根據(jù)癥狀將魔芋腐爛病劃分為n種類型，統(tǒng)計各癥狀樣品分離的每種菌株的平均分離頻率。計算公式如下。

(1)

式中，fi為平均分離頻率，Sn為具有每種癥狀的所有樣品分離的有效菌株總數(shù)，Sni為每種有效菌株的數(shù)量，i代表有效菌株編號。

1.4 細菌的16S rRNA基因序列分析

挑取單菌落于裝有1 mL LB培養(yǎng)液的1.5 mL的離心管中，28 ℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)14～18 h，10 000 r·min-1離心1 min，棄上清液，加入110 μL TE溶液和70 μL溶菌酶，37 ℃放置40 min。利用天根細菌基因組DNA提取試劑盒提取細菌DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

以細菌基因組DNA為模板，采用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′)和1492R(5′-ACGGTTACCTTACCTTGTTACGACTT-3′)[11]擴增待測細菌的16S rRNA基因序列。PCR反應體系：DNA模板5 μL，引物各2 μL，1.1×T3 Super PCR Mix 41 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性45 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸90 s，共32個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，產(chǎn)物保存在4 ℃?zhèn)溆?。擴增產(chǎn)物用1% 瓊脂糖凝膠電泳，120 V、20 min，點樣量4 μL，并設置陰性對照。將擴增產(chǎn)物送諾賽公司測序，測序結果在NCBI進行同源序列比對分析。

1.5 優(yōu)勢細菌B12、B13的致病性測定

選取優(yōu)勢細菌中可能的致病菌分離株B12和B13測定致病性。將兩菌株的單菌落分別接種于裝有100 mL LB培養(yǎng)液的三角瓶中，28 ℃、180 r·min-1培養(yǎng)12～18 h至OD值0.6。培養(yǎng)液4 ℃、10 000 r·min-1離心10 min，去上清，用磷酸緩沖液懸浮，計數(shù)，調(diào)節(jié)細菌濃度為108cell·mL-1，將懸液保存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

選取設施大棚避雨栽培模式下未種植過魔芋的田塊，種芋采用47%春雷王銅可濕性粉劑500倍與80%代森錳鋅可濕性粉劑1 000倍混和液消毒處理后播種。于魔芋幼苗期，選取長勢相近的健康魔芋測定細菌致病性。將制備的菌懸液稀釋100倍，每株苗澆300 mL，每個菌株接種30株魔芋，以澆灌清水為對照，設置3次重復。于接種后3周、5周分別進行魔芋發(fā)病癥狀和發(fā)病率調(diào)查。

1.6 利用特異引物對致病菌進行鑒定

在1.4細菌16S rRNA基因測序基礎上，采用胡蘿卜果膠桿菌特異性引物EXPCCF/EXPCCR[12]對試驗中分離獲得的7種細菌(9個分離株)的 DNA進行PCR擴增。擴增條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。120 V電泳20 min檢測其特異性。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用Excel軟件進行數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計。

2 結果與分析

2.1 魔芋樣品采集和發(fā)病癥狀調(diào)查

從十堰市鄖西鄉(xiāng)、周家洼、譚家灣和柳陂基地的魔芋種植地塊以及植保所盆栽魔芋苗共采集魔芋病株28株(表2)，其中21株具有細菌性病害癥狀；3株具有典型的白絹病癥狀(LB-1、LB-2、LB-5)；4株具有細菌和真菌復合侵染特征(YX-6、YX-8、YX-9、ZJW-1)，塊莖表面有白色菌絲，莖基部或莖稈腐爛。所有發(fā)病癥狀可分為莖基環(huán)狀軟腐型、黃化莖基黑爛型、黃化莖黑裂型、黃化莖干軟型、黃化莖基外黑內(nèi)紅型、莖上部或整株黒爛型六種類型(表2)。

2.2 病原菌的分離純化

從采集的28株發(fā)病魔芋中選取具有典型癥狀的18株樣品進行病原菌分離純化，共獲得94株細菌。根據(jù)細菌的單菌落形態(tài)特征，將分離到的細菌菌株歸納為48種。細菌菌落大小約在0.5～4.0 mm之間。菌落顏色有4種，其中B1、B2菌落呈黃白色，B3～B6菌落呈金黃色，B7菌落呈橘黃色，B8～B17菌落呈乳白色；除B2、B4～B6細菌菌落呈半透明外，其余菌落均不透明；除B7、B13、B14菌落明顯凸起外，其余均稍凸起；B9、B10、B12、B15～B17細菌不產(chǎn)生色素，其余均可產(chǎn)生色素，其中B1～B7以及B11、B13細菌產(chǎn)生黃色色素，B8和B14細菌分別產(chǎn)生褐色和金黃色色素。排除單次出現(xiàn)的菌株，共有17種有效菌株用于分離頻率的統(tǒng)計。

從樣品LB-1(表2)病株莖基部收集到的菌核經(jīng)抗生素溶液消毒后，轉接到加抗生素的1/2 PDA培養(yǎng)基上，1 d即可長出白色菌絲，菌絲生長迅速，3～5 d后形成褐色的菌核(圖1A)，其菌核和菌落形態(tài)同齊整小核菌Sclerotiumrolfsii。從樣品YX-3、YX-6、ZBS-2、ZBS-3和ZBS-4球莖內(nèi)部組織僅分離到一種真菌(圖1B)，菌絲白色、卷曲、羊毛狀、不豐富，顯微鏡下觀察可見鐮刀型孢子(圖1C)，因此將其鑒定為鐮刀菌，說明這些病株侵染菌可能為鐮刀菌。

表2 不同地點魔芋腐爛病的典型癥狀

注：A為齊整小核菌菌落形態(tài)，B、C分別為鐮刀菌的菌落形態(tài)和分生孢子形態(tài)。

2.3 細菌分離株的分離頻率與鑒定

根據(jù)魔芋發(fā)病的典型癥狀，結合對應樣品分離的有效菌株，計算所有菌株的平均分離頻率。根據(jù)細菌的16S rRNA基因序列分析結果(GenBank登錄號：MN874164-874180)對細菌菌株進行初步鑒定(表3)。

表3 不同細菌分離株的分離頻率與16S rRNA類別

根據(jù)16S rRNA基因序列分析結果，將相同序列的菌株合并進行重新歸類，并對合并后的11種菌株的平均分離頻率進行統(tǒng)計。結果(圖2)表明：胡蘿卜軟腐果膠桿菌(Pectobacteriumcarotovorumsubsp.carotovorum)(菌株B12、B16、B17)、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasmaltophilia)(菌株B4、B5、B6)、產(chǎn)酸克雷伯菌(Klebsiellaoxytoca)(菌株B13、B14)和Corticimicrobacterpopuli(菌株B10、B15)的平均分離頻率較高，分別為27.6%、17.6%、12.1%和10.8%。

圖2 11種細菌分離株的分離頻率

2.4 魔芋發(fā)病癥狀與細菌分離頻率和樣品采集地關系

不同地塊魔芋發(fā)病癥狀、病原菌的分離頻率有所不同(圖3)。柳陂主要發(fā)病類型為黃化莖基黑爛型和莖基環(huán)狀軟腐型，其中從黃化莖基黑爛型病樣中分離到的主要為細菌，P.carotovorumsubsp.carotovorum為優(yōu)勢細菌，分離頻率高達62.5%；而莖基環(huán)狀軟腐型的病原菌主要為齊整小核菌S.rolsfii，莖基環(huán)狀軟腐的發(fā)生可能與柳陂土壤本身帶菌或者種芋下鋪墊芝麻秸稈有關。鄖西土壤和植保所盆栽土為沙土，而且鄖西為避雨栽培模式，因而這兩個地點的發(fā)病率較低。這兩個地點的發(fā)病癥狀也不同于其他地點，分別為黃化莖黑裂型和黃化莖干軟型，均存在鐮刀菌和細菌的復合侵染。但兩地分離到的優(yōu)勢細菌不同，鄖西的優(yōu)勢細菌為S.maltophilia和P.carotovorumsubsp.carotovorum，植保所的優(yōu)勢細菌為P.carotovorumsubsp.carotovorum和K.oxytoca，說明不同環(huán)境條件下鐮刀菌和不同細菌復合侵染產(chǎn)生的病癥不同，可能與這兩個地點的土壤為沙土有關。譚家灣的發(fā)病植株主要為黃化莖基外黑內(nèi)紅型，優(yōu)勢細菌為P.carotovorumsubsp.carotovorum和C.populi，分離頻率分別高達 60.0%和30.0%；周家洼的發(fā)病類型主要為莖上部或整株黒爛，優(yōu)勢細菌為S.maltophilia和P.carotovorumsubsp.carotovorum。從這兩個地點分離到人類的機會病原，且植株腐爛度高，可能與這兩個地點均施用了未腐熟的農(nóng)家肥或沼肥有關。

圖3 不同地區(qū)的細菌分離頻率與魔芋發(fā)病率

2.5 細菌分離株的致病性

兩株待測細菌對魔芋的致病性不同。胡蘿卜軟腐果膠桿菌B12菌懸液澆灌處理后，魔芋發(fā)病率最高，接種菌懸液3周后發(fā)病率已達60%，5周后發(fā)病率達到了80%(表4)。發(fā)病癥狀為：莖稈從基部開始發(fā)黑、軟、折，隨后整株腐爛，為典型的魔芋軟腐病的發(fā)病特征。產(chǎn)酸克雷伯菌B13菌株的菌懸液接種后魔芋發(fā)病率與清水對照處理未達到極顯著水平。綜合以上結果，確認B12菌為魔芋腐爛病的致病菌。

表4 兩株優(yōu)勢細菌菌懸液澆灌魔芋幼苗后的發(fā)病率

2.6 軟腐病菌特異性鑒定

在供試的7種細菌9個分離株中，利用特異性引物EXPCCF/EXPCCR只能從鑒定為胡蘿卜軟腐病菌(P.carotovorumsubsp.carotovorum)的B12、B16 和B17基因組DNA中擴增到大小為550 bp左右的特異性DNA條帶(圖4)，進一步證明這三個分離株為胡蘿卜軟腐病菌。

注Note：M—Marker, 2 000 bp;1—Acinetobacter sp.;2—Stenotro-phomonas sp.;3—Empedobacter sp.; 4—Pseudomonas sp.; 5—Serratia sp.; 6—Klebsiella oxytoca; 7—ddH2O; 8～10—P. carotovorum subsp.carotovorum.

3 討論

魔芋腐爛病是十堰市魔芋生產(chǎn)中的重要病害，人們常將魔芋腐爛病和魔芋軟腐病混淆，統(tǒng)稱為魔芋軟腐病。前人研究多關注魔芋腐爛病的發(fā)病率和病原菌的種類，很少有研究注意魔芋生長地的環(huán)境條件、栽培措施與魔芋腐爛病發(fā)生之間的關系。本研究對湖北省十堰市魔芋腐爛病的病原菌分離和致病性測定結果表明：胡蘿卜軟腐果膠桿菌(P.carotovorumsubsp.carotovorum)是十堰市魔芋腐爛病的重要致病菌，與前人有關魔芋細菌性軟腐病原菌的研究報道一致[13-16]；此外，還發(fā)現(xiàn)齊整小核菌和鐮刀菌也是魔芋腐爛的重要致病菌(圖2)，與細菌存在復合侵染。如：鄖西和植保所發(fā)病魔芋為鐮刀菌和細菌的復合侵染。因兩地所使用的種芋相同，而植保所使用的盆栽土為未種植過作物的沙土，因此推測鐮刀菌是由種芋攜帶的，生產(chǎn)中應加強種芋消毒。本研究的致病性測定采用47%春雷王銅可濕性粉劑和80%代森錳鋅可濕性粉劑對種芋進行消毒處理，對照魔芋發(fā)病率較低(9.38%)，說明所使用的種芋消毒藥劑可以有效控制魔芋腐爛病的發(fā)生，因而建議生產(chǎn)中使用新型復配殺菌劑進行種芋消毒以提高魔芋腐爛病的防控效果。柳陂的魔芋腐爛主要為齊整小核菌和細菌的復合侵染導致。齊整小核菌可能是由于種植時鋪墊芝麻秸稈造成的。王雅等[17]曾報道，引起芝麻白絹病的病原菌為齊整小核菌Sclerotiumrolfsii，該病原菌可侵染多種植物，提示一定要注意栽培措施、種植土壤中病原真菌S.rolfsii的監(jiān)測，在防控措施上可采用土壤深翻、高起垅、及時排除積水等措施減輕病害的發(fā)生[18]。

胡蘿卜軟腐果膠桿菌(P.carotovorumsubsp.carotovorum)是一種具有鞭毛的細菌，土壤濕度大、雨水多會加重病害的發(fā)生[2-3]。研究中五個采樣點的發(fā)病率從高到低依次為柳陂>周家洼>譚家灣>植保所>鄖西。鄖西和植保所發(fā)病率低可能與栽培土壤和栽培措施有關。這兩個地點的栽培土壤均為沙土，而且鄖西為避雨栽培模式，土壤水分少，栽培過程中沒有雨水的沖刷，從而減少了病原菌的傳播和侵染，減輕了病害的發(fā)生。其他三個地點均為粘土，土壤濕度大，增加了病原菌的侵染。因此魔芋腐爛病防控中要加強水分管理，應及時排水，避免田間積水而加重病害的發(fā)生。此外，從周家洼、鄖西重病樣中除分離到Pectobacterium外，還分離到多種其他細菌，如Pseudomonassp.(B3)、Empedobactersp.(B7)、Stenotrophomonasmaltophilia(B4、B5)。從有臭味的樣品ZJW-2中還分離到了Serratiasp.。這些細菌的存在可能與采集的樣品發(fā)病嚴重或與周家洼農(nóng)民種植的魔芋地施用了有機肥，田塊不平整，積水嚴重有關。有報道假單胞菌屬(Pseudomonas)、不動桿菌屬(Acinetobacter)、短穩(wěn)桿菌屬(Empedobacter)和沙雷氏菌屬(Serratia)對某些植物具有致病性[19-20]，提示需要注意使用腐熟的肥料，避免因農(nóng)耕措施不當造成病害加重。