王立光, 葉春雷, 陳軍, 李進京, 羅俊杰

(甘肅省農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所, 蘭州 730070)

在一塊土地上連續(xù)種植同種或近緣作物會使土壤環(huán)境惡化，導致下茬作物長勢變差、產(chǎn)量和品質(zhì)降低，這種現(xiàn)象被稱為連作障礙[1-3]。連作障礙已成為困擾農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的一個焦點問題，備受國內(nèi)外學者的關注。不同作物對連作的耐受性有較大差異，有的作物連作二至三年就會表現(xiàn)出明顯的連作障礙，而有的作物則需要連作數(shù)年甚至十數(shù)年才出現(xiàn)連作障礙[4-6]。目前研究認為,土壤理化性質(zhì)、土壤微生物群落及自毒作用是引發(fā)連作障礙的主要因素，且這些因素均通過土壤對作物產(chǎn)生影響[7-10]。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中，人們發(fā)現(xiàn)采用間作和輪作是防止連作障礙發(fā)生的種植模式，能有效改善農(nóng)業(yè)生態(tài)，實施合理的間作和輪作制度有利于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展[11-17]。

胡麻(Linumusitatissimum)為一年生草本油用纖維作物，是我國西北和華北黃土高原地區(qū)重要的油料作物。胡麻的品種選育、產(chǎn)業(yè)深加工和胡麻油的利用等方面已經(jīng)取得一系列科研成果[18-24]。在長期農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，農(nóng)戶發(fā)現(xiàn)在同一塊土地上連續(xù)種植胡麻兩年后，第三年繼續(xù)種植胡麻會導致產(chǎn)量顯著降低；而利用間作或輪作的種植模式后，可以明顯改善這種連作障礙。研究表明，胡麻連作兩年會導致土壤水提液的自毒作用明顯加強，抑制種子萌發(fā)、影響植株生長，同時還會降低土壤酶活性，而間作或輪作可以有效緩解這些不利影響[25-26]。目前，關于緩解胡麻連作障礙的研究雖然已經(jīng)取得一些成果，但是引入小麥與胡麻進行間作或輪作，對于改善土壤理化性質(zhì)、減少自毒作用及對微生物群落等的影響，仍需要設置詳細的大田試驗，通過對比研究以期獲得進一步的試驗證據(jù)。因此，本研究于甘肅省內(nèi)低、中位山旱地設置試驗點，研究胡麻連作(凈作)、胡麻/小麥條帶間作和胡麻-小麥輪作對土壤理化性質(zhì)、土壤酶活性、土壤自毒作用及下茬胡麻生長和產(chǎn)量的影響，探索引入小麥開展間作或輪作，打破胡麻連作障礙的機制，優(yōu)化胡麻與小麥輪作或間作的栽培模式，為胡麻高產(chǎn)高效栽培及區(qū)域農(nóng)業(yè)資源的可持續(xù)利用提供理論和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取甘肅省農(nóng)業(yè)科學院選育的胡麻品種隴亞10號為試驗材料，該品種具有抗旱、抗倒伏、高抗枯萎病的特性，高度適于甘肅省低、中位山旱地種植；選取小麥品種隴春20號為間作或輪作材料，由甘肅省農(nóng)業(yè)科學院小麥研究所提供。

1.2 試驗設置

試驗地點位于甘肅省榆中縣良種廠(E 104°06′、N 35°50′), 海拔高度約1 600 m。分別設置胡麻連作兩年(CC2，連續(xù)種植胡麻兩年；第三年繼續(xù)種植胡麻記作CC3)、胡麻/小麥間作(CI，第一年種植胡麻，第二年胡麻和小麥間作，第三年仍為胡麻和小麥間作)和胡麻-小麥輪作(CR，第一年種植胡麻，第二年小麥輪作，第三年再次種植胡麻)3種種植模式，每個處理重復3次，采用隨機區(qū)組設計，每個小區(qū)面積27 m2(4.5 m×6.0 m)。小區(qū)之間采用高50 cm、寬60 cm的土埂間割。每小區(qū)胡麻種植時每行播種量相同。均于第三年種子萌發(fā)一個月后測定株高，之后每隔1月測量一次，直至收獲。收獲后測定胡麻單株產(chǎn)量、千粒重及小區(qū)產(chǎn)量。

1.3 土樣采集

試驗第二年，于收獲后分別對胡麻連作兩年、胡麻-小麥間作和輪作后的根際土壤呈“S”型布點進行采集，保證每小區(qū)至少10～12個采樣點，將采集后的土壤充分混勻，剔除枯葉、腐葉后一部分土樣用于土壤理化性質(zhì)、酶活性及微生物群落測定，剩余部分用于水提液的制備。

1.4 土壤酶活性測定

參照王立光等[27]的方法，采用3,5-二硝基水楊酸比色法測定土壤蔗糖酶活性；采用磷酸苯二鈉法測定堿性磷酸酶活性；采用高錳酸滴定法測定過氧化氫酶活性；采用靛酚藍比色法測定脲酶活性。

1.5 土壤水提液制備及自毒作用測定

土壤水提液制備及自毒作用測定參照王立光等[27-28]方法，具體為：稱取60 g樣品放入棕色試劑瓶內(nèi)，加入蒸餾水600 mL，充分震蕩混勻后置于搖床振蕩提取48 h后，過濾獲得浸提液母液(100 mg·mL-1)置于4 ℃冰箱保存。選取大小均一的隴亞10號種子，20%次氯酸鈉消毒13～15 min，滅菌蒸餾水漂洗至少6～8次后，均勻擺放在鋪有兩層濾紙的無菌培養(yǎng)皿中，每皿40粒，對應皿中加入相應濃度的提取液8 mL, 對照組利用蒸餾水(CK)替代，每處理3次重復。培養(yǎng)皿置于光暗各12 h、25 ℃恒溫的培養(yǎng)箱內(nèi)，以胚根突破種皮作為種子萌發(fā)的測定標準。試驗中，每隔1 d加入3 mL對應濃度的提取液，用于保持濾紙濕潤，每隔24 h統(tǒng)計一次發(fā)芽粒數(shù)；并于第3天統(tǒng)計發(fā)芽勢(germination potential, GP)；第7天統(tǒng)計發(fā)芽率(germination rate，GR)和發(fā)芽指數(shù)(germination index，GI)；挑選10株第1天開始萌發(fā)的幼苗，測定株高(shoot length，SL)、根長(Root length，RL)、苗鮮重(shoot weight，SW)和根鮮重(root weight，RW)。計算各處理的發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)(vigor index，VI)，并計算各指標的化感作用抑制率(response index，RI)，從而計算得到綜合效應(synthesis effect，SE)。

1.6 土壤微生物群落結構測定

土壤樣品為混合土樣，將每處理的3個重復土樣充分混合，用四分法取適量土樣置于自封袋內(nèi)，用干冰保存，帶回實驗室進行后續(xù)分析。準確稱取0.1 g土樣，按照土壤微生物DNA提取試劑盒(MOBIO,12888-100)說明書步驟，分別提取土樣的總DNA，Thermo NanoDrop 2000超微量分光光度計測定DNA濃度和純度,1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性，合格樣品交由美吉生物醫(yī)藥科技公司進行細菌和真菌測序。

1.7 數(shù)據(jù)處理和分析

采用Microsoft Excel 2010軟件進行原始數(shù)據(jù)的整理和分析，通過SPSS 20.0軟件進行單因子方差分析，用新復極差法(Duncan)進行顯著性分析，利用Adobe Photoshop和Sigmaplot 10.0軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 胡麻/小麥間作和胡麻-小麥輪作對土壤理化性質(zhì)的影響

表1表明，CI和CR土壤pH、有機質(zhì)、有效磷、速效鉀、全氮、全磷和全鉀含量均顯著低于CC2；CR土壤的pH、有機質(zhì)、有效磷和速效鉀含量又顯著低于CI，全氮、全磷和全鉀含量與CI差異不顯著；而CR土壤堿解氮含量最高，CC2次之，CI土壤中的堿解氮含量最低。由此可見，三種種植模式下土壤養(yǎng)分表現(xiàn)為CC2>CI>CR，說明連作導致土壤堿化，降低了土壤肥料利用率，而間作和輪作不同程度地緩解了土壤的堿化程度，加強了作物對土壤有機質(zhì)及磷肥和鉀肥的利用。

表1 不同處理土壤的基本理化性質(zhì)

2.2 胡麻/小麥間作和胡麻-小麥輪作對土壤酶活性的影響

第二年收獲后測定土壤酶活性,結果(圖1)表明，CI和CR土壤的酶活性高于CC2。其中，土壤蔗糖酶活性表明，CI和CR與CC2的土壤蔗糖酶活性均無顯著差異。土壤脲酶活性表現(xiàn)為CR中活性最高，較CC2顯著增加15.4%；而CI與CR、CC2差異不顯著。過氧化氫酶活性在不同種植模式下表現(xiàn)為：CR土壤中活性顯著高于CI，較CI提高7.1%；而CI土壤中過氧化氫酶活性又顯著高于CC2，較CC2提高4.2%，即：CR>CI>CC2。CI與CC2土壤的堿性磷酸酶活性相似，無顯著差異，均顯著低于CR。

注：不同小寫字母表示不同處理間差異在P<0.05水平顯著。

2.3 胡麻/小麥間作和胡麻-小麥輪作對土壤化感效應的影響

不同種植模式的土壤水提液對胡麻影響的綜合效應為：CR>CI>CC2(圖2)。CR土壤水提液綜合效應為0.21%，表現(xiàn)出微弱的促進作用；CI土壤水提液綜合效應為-0.77%，表現(xiàn)出微弱的抑制作用；而CC2土壤水提液綜合效應為-6.61%，表現(xiàn)為較強的抑制作用。由此說明，與小麥間作或輪作均不同程度消減了土壤的自毒效應，而連作種植胡麻使土壤產(chǎn)生較強的自毒作用。

注：不同小寫字母表示不同處理間差異在P<0.05水平具有顯著性。

2.4 胡麻/小麥間作和胡麻-小麥輪作對土壤微生物群落的影響

基于細菌16S rDNA和真菌ITS的高通量測序結果(圖3)表明，CI和CR土壤細菌群落的Shannon指數(shù)與CC2間無顯著差異；而CR土壤真菌群落的Shannon指數(shù)(3.37)顯著低于CI(4.11)和CC2(4.07)。由此表明，與連作相比，間作和輪作小麥后土壤細菌群落的多樣性差異較小，但輪作降低了土壤真菌的多樣性。

注：不同小寫字母表示不同處理間差異在P<0.05水平顯著。

對土壤細菌分析(圖4)發(fā)現(xiàn)，CI、CR和CC2土壤細菌分別涉及33、35和34個門類，其中有32個細菌門類為三者共有；CI和CR中檢測到的衣原體門(Chlamydiae)在CC2土壤中未檢測到；而CR和CC2土壤檢測到的GAL15菌門和Peregrinibacteria菌門在CI土壤中未檢測到。對土壤細菌優(yōu)勢菌門分析表明，CI和CR與CC2土壤內(nèi)相對豐度排名前六的優(yōu)勢菌均相同，依次為變形菌門(Proteobacteria)、酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、綠灣菌門(Chloroflexi)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)。這6類優(yōu)勢菌門的相對豐度均占各土壤細菌的80%以上；但不同土壤內(nèi)各優(yōu)勢細菌門的相對豐度存在差異。變形菌門在CI和CR土壤內(nèi)的相對豐度較為接近，分別為24.9%和24.5%；而在CC2土壤內(nèi)的相對豐度為28.4%。酸桿菌門在CR土壤內(nèi)相對豐度為29.1%;而在CI和CC2土壤內(nèi)的相對豐度均為20.9%。放線菌門在各土壤內(nèi)的相對豐度為：CI(19.2%)>CC2(13.6%)>CR(9.9%)。綠灣菌門在各土壤內(nèi)的相對豐度較為一致，分別為11.9%(CI)、11.2%(CR)和10.9%(CC2)。擬桿菌門在各土壤內(nèi)的相對豐度情況與變形菌門相似，在CC2土壤內(nèi)為10.8%，高于CI(6.9%)和CR土壤(7.0%)的相對豐度。芽單胞菌門在CC2土壤內(nèi)的相對豐度為4.4%，低于CI(5.6%)和CR土壤(6.2%)。聚類分析表明，CI和CC2土壤細菌群落的相似度較高，而與CR土壤細菌群落結構差異較大。

真菌測序結果(圖4)表明，三種土壤中真菌均來自于6個門，分別為子囊菌門(Ascomycota)、接合菌門(Zygomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、球囊菌門(Glomeromycota)、壺菌門(Chytridiomycota)和真菌界下未分類門(unclassified-k-Fungi)。其中，優(yōu)勢菌群為子囊菌門，在各處理土壤內(nèi)真菌群落分別占75.6%(CI)、57.3%(CR)和67.5%(CC2)。CR土壤內(nèi)真菌界下未分類菌門占比(24.0%)顯著高于CI(6.8%)和CC2(8.3%)土壤。接合菌門在各處理土壤內(nèi)占比相近，分別占真菌群落的10.9%(CI)、13.0%(CR)和11.2%(CC2)。擔子菌門和球囊菌門在CC2土壤內(nèi)的占比分別為11.2%和1.2%，顯著高于CI(6.4%和0.1%)與CR(5.2%和0.2%)。壺菌門在三種土壤內(nèi)的占比均為最低。真菌聚類結果與細菌聚類結果一致，CR土壤真菌群落結構與CI和CC2差異較大，而CI和CC2土壤真菌群落的相似度較高。

圖4 土壤中細菌和真菌群落的β多樣性分析及豐度變化

以上結果表明，種植模式導致土壤生態(tài)系統(tǒng)中的細菌和真菌群落的組成及比例發(fā)生變化。

2.5 胡麻/小麥間作和胡麻-小麥輪作對后茬胡麻生長及產(chǎn)量的影響

與CC3相比，CI和CR有利于下茬胡麻的生長和高產(chǎn)，輪作效果優(yōu)于間作(圖5)。對第三年胡麻生長過程測定表明，萌發(fā)至兩個月內(nèi)的胡麻株高在各處理間無顯著差異；但之后至收獲，CC3株高顯著低于CI和CR，且CR又顯著高于CI。收獲期CR和CI后再植胡麻的株高分別比CC3株高增加16.3%和7.7%，CR比CI增加7.9%。籽粒千粒重及產(chǎn)量比較表明，連作導致單株產(chǎn)量和千粒重明顯降低，而CI和CR間的胡麻籽粒千粒重無顯著差異，均較CC3千粒重增加51.0%左右；CR處理后再植胡麻的單株產(chǎn)量較CI增產(chǎn)24.0%，較CC3增產(chǎn)81.3%，CI處理后再植胡麻的單株產(chǎn)量較CC3增產(chǎn)46.2%。由此表明CI處理后種植胡麻的結實率可能低于CR。小區(qū)產(chǎn)量也表現(xiàn)出與單株產(chǎn)量相同的趨勢，即CR>CI>CC3，CR和CI的小區(qū)產(chǎn)量分別是CC3小區(qū)產(chǎn)量的1.68和1.36倍。

注：不同小寫字母表示不同處理間差異在P<0.05水平顯著。

3 討論

間作和輪作倒茬是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中用地養(yǎng)地相結合的有效措施，研究表明，合理的間作或輪作可以協(xié)調(diào)作物間養(yǎng)分吸收，增加土壤的養(yǎng)分，提高土壤酶活，減弱自毒效應，改善微生物群落結構，從而消減連作障礙的影響[6, 16, 29-32]。土壤pH是影響土壤肥力的重要因素之一，對作物生長具有重要影響，過酸或過堿均不利于作物生長，連作會使土壤pH升高或降低[17, 33-34]，而間作和輪作具有穩(wěn)定土壤pH的作用。張月萌等[31]研究發(fā)現(xiàn)，間作苜蓿或三葉草可以使土壤pH在山藥根莖膨大初期和盛期顯著低于連作土壤；但馮世鑫等[34]對黃花蒿研究發(fā)現(xiàn)，黃花蒿與作物輪作的土壤pH高于連作土壤。本研究顯示，胡麻-小麥間作或輪作后土壤pH低于連作土壤，說明胡麻連作有使土壤堿化的趨勢，而間作緩解了這一趨勢，輪作的作用則更加顯著，這很可能是消減胡麻連作障礙的一個重要因素。張月萌等[31]研究表明，間作苜蓿和三葉草使土壤中硝態(tài)氮、速效鉀和速效磷含量高于連作土壤[31]；剡斌[35]研究顯示，胡麻與小麥、馬鈴薯輪作提高了0—60 cm土層土壤有機質(zhì)、全氮和速效磷含量，卻降低了該土層土壤全磷和銨態(tài)氮含量。本研究與前人結果存在一定差異，胡麻-小麥間作或輪作后土壤有機質(zhì)、全磷、全鉀、全氮、有效磷和有效鉀含量與連作土壤相比均呈逐漸下降趨勢，與萬年鑫等[36]對馬鈴薯連作的研究結果相一致。造成這種趨勢的原因可能是胡麻連作導致土壤環(huán)境發(fā)生變化，從而不利于胡麻根系對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用，導致連作土壤內(nèi)有機質(zhì)含量較高；而胡麻-小麥間作或輪作使得作物可以充分吸收利用土壤中的營養(yǎng)物質(zhì)。這也暗示，連作障礙并不能依靠施用化肥來消減，化肥的過度使用可能會對胡麻生產(chǎn)造成進一步的不利影響。由此表明，土壤理化性質(zhì)的改變不僅受栽培方式的影響，還與種植的作物相關。因此，對不同作物的栽培模式及間作或輪作作物的選擇要根據(jù)情況來選擇。

土壤酶活性是土壤質(zhì)量的表征，也是土壤健康評估的主要參數(shù)[37]。間作研究發(fā)現(xiàn)，與番茄單作相比，番茄與架豆、地豆、莧菜間作均可提高土壤蔗糖酶和磷酸酶活性；與架豆和地豆間作還可以提高土壤脲酶活性；與地豆和莧菜間作可降低土壤過氧化氫酶活性[38]。張月萌等[31]研究發(fā)現(xiàn)，山藥間作苜?；蛉~草可提高土壤脲酶、蔗糖酶和堿性磷酸酶活性。輪作也可提高部分土壤酶活性，從而提高土壤肥效，如馬鈴薯與玉米輪作可提高土壤脲酶、蔗糖酶和過氧化氫酶活性[36]。王麗紅等[39]用小麥和豌豆與馬鈴薯輪作發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯與豌豆輪作使馬鈴薯成熟期土壤過氧化氫酶、脲酶和蔗糖酶活性升高；而馬鈴薯與小麥輪作僅使土壤蔗糖酶活性升高。本研究利用小麥與胡麻間作發(fā)現(xiàn)，收獲期土壤中過氧化氫酶活性顯著升高；而小麥與胡麻輪作使土壤脲酶、過氧化氫酶和堿性磷酸酶活性均顯著高于連作土壤。由此表明，土壤酶活性的改變不僅和種植模式有關，也受輪作或間作作物及生長時期的影響。

自毒作用被認為是導致連作障礙的主要原因之一。作物通過根系分泌、淋洗和殘體分解等方式使有毒物質(zhì)進入土壤。郭俊霞等[40]研究表明，丹參連作的土壤水提液對幼苗生長和生理指標均有不同程度的抑制作用。黃鈺芳等[41]研究顯示，百合連作的土壤水提液對幼苗有明顯的抑制作用。也有研究證明，隨百合連作年限增加，鄰苯二甲酸等植物毒性化感物質(zhì)在土壤中積累，導致毒害[42]。本研究顯示，胡麻連作的根際土壤水提液對胡麻的綜合效應為抑制作用，而胡麻與小麥間作使抑制作用明顯減弱，胡麻與小麥輪作則表現(xiàn)為促進作用。這表明與連作相比，間作和輪作使自毒作用減弱，自毒物質(zhì)的積累量相應降低，有利于下茬胡麻的生長。因此，在生產(chǎn)中通過人為干預土壤內(nèi)自毒物質(zhì)的積累，有利于胡麻連作障礙的消減。

細菌、真菌和放線菌是土壤微生物的主要菌群。譚雪蓮等[43]發(fā)現(xiàn)馬鈴薯連作后土壤內(nèi)細菌和放線菌的數(shù)量隨連作年限的增加而下降，真菌數(shù)量則上升。王麗紅等[39]研究發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯連作后，土壤內(nèi)細菌和真菌數(shù)量均隨連作年限的增加而降低；而采用小麥、豌豆等與馬鈴薯輪作可以提高土壤內(nèi)細菌和放線菌數(shù)量，降低真菌數(shù)量。高林等[44]發(fā)現(xiàn)，烤煙連作后土壤細菌的Shannon指數(shù)和Chaol指數(shù)隨著連作年限的增加均呈現(xiàn)下降趨勢；而土壤真菌的Shannon指數(shù)呈上升趨勢；且菌落結構組成也發(fā)生了較大變化。本研究顯示，胡麻和小麥間作或輪作使土壤內(nèi)細菌和真菌的群落結構組成與連作土壤有明顯差異，與前人的研究結果一致；但土壤內(nèi)細菌多樣性無顯著變化，推測可能是由于胡麻連作年限較短，對細菌的影響較小，這一現(xiàn)象與孫秀山等[45]及殷繼忠等[46]對花生和大豆連作研究結果相似。除此之外，本研究發(fā)現(xiàn)胡麻與小麥輪作對土壤真菌群落多樣性的影響明顯大于間作，這可能是由于間作存在部分胡麻持續(xù)作用的結果。

連作障礙表現(xiàn)為植物生長發(fā)育狀況變差、產(chǎn)量下降、品質(zhì)降低。而合理的間作或輪作可以消減連作障礙的發(fā)生。姚虹等[47]研究發(fā)現(xiàn)，胡麻連作后保苗率、平均株高、單株蒴果數(shù)和千粒重等都低于輪做。陳軍等[48]通過對收獲期胡麻株高及產(chǎn)量研究發(fā)現(xiàn)，間作可以在一定程度上消減連作帶來的負面效應，輪作可以有效消減連作危害。另外豆科與番茄間作也表明，間作可以使番茄的株高和產(chǎn)量增加[38]。這些結果與本研究結果相一致，表明胡麻/小麥間作和胡麻-小麥輪作均可消減連作障礙對胡麻生長和產(chǎn)量的負面影響，且輪作效果優(yōu)于間作。但間作或輪作消減連作障礙的機理還需要進一步研究。