張 葉，趙昌輝，張鐵華

（吉林大學食品科學與工程學院，吉林長春130000）

0 引言

中國林蛙，俗名又稱蛤士蟆、雪蛤，主要分布在我國東北地區(qū)和中原地區(qū)，是一種珍貴的藥食兼用的經(jīng)濟型動物[1]。林蛙通常在2月份進入繁殖期，從繁殖期的雌蛙體內(nèi)取出的輸卵管即為林蛙油，而林蛙卵就是剝離輸卵管后剩余的副產(chǎn)物[2]。據(jù)統(tǒng)計，每只林蛙一年最多可產(chǎn)1 200～1 300顆卵。在每年林蛙的人工養(yǎng)殖場地中，林蛙卵的產(chǎn)量約為林蛙油的8倍。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，林蛙卵的營養(yǎng)價值并不低，甚至可能高于目前被市場廣泛認可的林蛙油。林蛙卵中含有種類豐富的蛋白質(zhì)，以及不飽和脂肪酸、多種人體必需氨基酸、維生素和雌激素等營養(yǎng)物質(zhì)[3]，具有極大的開發(fā)潛力。林蛙卵中蛋白含量多且種類豐富，約占卵總組分的16.8%，王宇等人[4]采用高效液相色譜技術(shù)和氨基酸分析儀測定表明，卵蛋白中包含人體營養(yǎng)需要的9種必需氨基酸，其中天冬氨酸和谷氨酸含量最高。陶鳳云等人[5]利用有機溶劑分級沉淀加多種色譜技術(shù)的方法分離得到一種蛋白質(zhì)，具有RNA酶活性。這種具有RNA酶活性的林蛙卵蛋白可有效抑制癌細胞生長[6]。張肅等人[7]得出了林蛙卵蛋白對抗疲勞有積極作用的結(jié)論。這些研究證實了林蛙卵蛋白的生理活性但沒有測定過它的基礎(chǔ)功能特性和蛋白組成。

蛋白的功能特性是指其在食品加工過程及運輸貯藏條件下在食品體系中起到的特殊作用，物理、化學等多方面作用及共同作用都包含其中。林蛙卵中的蛋白含量高表明其在食品工業(yè)中有很大的應用潛力。對林蛙卵蛋白的基本功能特性（如溶解性、持水性、凝膠性、起泡性、乳化性等性質(zhì)）要有深入的了解，才能根據(jù)其功能特點決定在食品配方中的具體用途[8]，從而提升林蛙卵蛋白在食品工業(yè)中的應用價值。

1 材料及方法

1.1 材料

林蛙干卵，吉林通化康元生物公司提供；正己烷、氫氧化鈉、鹽酸均為食品級，北京化工廠提供。

1.2 儀器與設備

XMTD-8222型電熱恒溫水浴鍋，北京長源實驗設備廠產(chǎn)品；ML204TS型電子分析天平，德國IKAC公司產(chǎn)品；IKAC-HS7型磁力加熱攪拌器，德國IKAC公司產(chǎn)品；AVANTIJ-E型高速離心機，美國貝克曼公司產(chǎn)品；PHS-3c型雷磁pH計，中國上海精科儀器有限公司產(chǎn)品；Alphal-2型冷凍干燥機，德國Martin Christ公司產(chǎn)品；SyergyhtHT型酶標儀，美國Biotek公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 林蛙卵蛋白的提取

林蛙卵的蛋白提取參考金紅等人[9]、李知興等人[10]的方法并加以改動。取適量林蛙卵于40℃烘箱中烘干2 h，取出后放入自封袋于干燥器中儲存?zhèn)溆?。以正己烷作為提取劑對蛙卵進行浸提脫脂，在料液比1∶8（g∶mL），溫度40℃的條件下恒溫振蕩4 h，然后以轉(zhuǎn)速3 000 r/min離心20 min，棄去提取液，反復浸提3次。在通風櫥內(nèi)揮發(fā)掉殘余有機溶劑，然后將脫脂后的蛙卵經(jīng)烘干粉碎成脫脂林蛙卵粉。

取脫脂后的蛙卵用粉碎機粉碎，過60目篩，得到林蛙卵粉放入自封袋后于干燥器中儲存?zhèn)溆?。采用堿溶酸沉法提取林蛙卵蛋白。取一定量脫脂林蛙卵粉與水按1∶10（g∶mL）混合，攪拌30 min使其充分溶脹，用1 mol/L NaOH調(diào)pH值至11.0，50℃下恒溫水浴攪拌90 min后，以轉(zhuǎn)速5 000 r/min離心20 min，收集上清液。沉淀按原料液比再提取2次，合并3次上清液，用1 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH值至4.5，4℃下靜置12 h后以轉(zhuǎn)速8 000 r/min離心20 min，收集沉淀。沉淀加水調(diào)pH值至7.0，然后攪拌使沉淀復溶。冷凍干燥得林蛙卵蛋白粉。

1.3.2 林蛙卵蛋白的溶解性

林蛙卵蛋白的溶解度用氮溶解指數(shù)NSI來表示。蛋白濃度通過BCA快速測定試劑盒來完成，然后計算氮溶解指數(shù)。加好樣品的96孔板迅速放到37℃恒溫培養(yǎng)箱中保溫30 min，顯色結(jié)束后迅速于波長562 nm處測定吸光度。另取樣品液在4℃條件下以轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心15 min，離心后的上清液按照同樣步驟操作，控制溫度和時間條件與之前一致，測定其在波長562 nm處的吸光度。每個樣品做3次平行。根據(jù)BSA標準品繪制的標準曲線Y=1.168 1X+0.128 2，R2=0.998 4計算樣品中的蛋白含量，溶解性（NSI）計算公式如下：

1.3.3 林蛙卵蛋白的持水性

林蛙卵蛋白的持水性測定根據(jù)Qin X S等人[11]的方法并稍作修改。準確稱取1 g林蛙卵蛋白樣品（A1）于50 mL離心管中，緩慢加入蒸餾水，邊加水邊攪拌，直到樣品變成輕微流動性的糊狀，但不到能溶解的程度，然后將玻璃棒上的殘留洗到離心管中，隨后將蛋白糊在恒定溫度下保溫30 min，靜置結(jié)束后室溫條件下以轉(zhuǎn)速3 200 r/min離心5 min，緩緩傾斜離心管，使其中的多余水分流出，用濾紙吸取壁上殘留的水分然后稱取蛋白糊質(zhì)量A2，根據(jù)公式（2）計算蛋白持水性，每個樣品做3次平行。

1.3.4 林蛙卵蛋白的起泡性

林蛙卵蛋白的起泡性測定參考Kuan Y H等人[12]的方法并適當修改。

（1）起泡性。配制1%質(zhì)量分數(shù)的蛋白樣品，調(diào)pH值，磁力攪拌30 min使之充分溶解后轉(zhuǎn)移到100 mL容量大小的量筒中并記錄初始體積V1，隨后以轉(zhuǎn)速10 000 r/min在高速剪切機下固定量筒作用2 min，記錄剪切作用結(jié)束時的溶液體積V2。每個樣品做3次平行。林蛙卵蛋白的起泡能力和起泡穩(wěn)定性用以下公式計算：

式中：V1——樣品初始體積，mL；

V2——均質(zhì)剛結(jié)束時的液體體積，mL。

（2）起泡穩(wěn)定性。將上述高速剪切結(jié)束后的樣品靜置30 min，然后再記錄此時的液體體積V3，用公式（4）計算其起泡穩(wěn)定性：

式中：V3——樣品高速剪切結(jié)束30 min后的液體體積，mL。

1.3.5林蛙卵蛋白的乳化性

林蛙卵蛋白的乳化性測定根據(jù)Haiying Chen等人[13]的方法并稍作改動。分別配制蛋白質(zhì)量分數(shù)為0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%（W/V）的樣品，調(diào)pH值至9。然后在9 mL蛋白溶液樣品中加入3 mL新鮮購買的葵花籽油，以轉(zhuǎn)速10 000 r/min在高速剪切機下固定量筒作用1 min。作用結(jié)束后迅速吸取20 μL溶液與5 mL 0.1%（W/V）的SDS溶液搖晃均勻，然后立即于波長500 nm處測定吸光值（A0），不加樣品的0.1% SDS溶液是試驗的空白對照；經(jīng)過剪切作用后的蛋白樣品要靜置10 min后再次取下清液，并按上述步驟測定吸光值（A1）。林蛙卵蛋白的乳化活力和乳化穩(wěn)定性分別用乳化活性指數(shù)（EAI）和乳化穩(wěn)定性指數(shù)（ESI）來表示，它們的計算公式如下：

式中：D——稀釋倍數(shù)，D=250；

C——蛋白質(zhì)濃度，mol/mL；

Φ——油相所占的比例，Φ=1/4；

L——比色皿的厚度，L=1 cm；

Δt=10 min。

1.3.6 林蛙卵蛋白的蛋白組分鑒定

蛋白酶解：取100 μg蛋白使用FASP法進行蛋白質(zhì)酶解，具體步驟如下：

（1）加入濃度為8 mol/L的Urea將體積補足至200 μL；

（2）向溶液中加入DTT試劑，使它的終濃度為10 mmol/L，然后在56℃水浴下反應30 min；

（3）在向溶液中加入IAA試劑，使它的終濃度為50 mmol/L，室溫下用錫紙包裹嚴密，避光反應40 min；

（4）將反應結(jié)束的樣品轉(zhuǎn)移至10 K的超濾管中，室溫條件下以轉(zhuǎn)速12 000 r/min離心5 min，棄掉濾液；

（5）在濾管中加入8 mol/L的Urea 400 μL，室溫下以轉(zhuǎn)速12 000 r/min離心5 min，再棄掉濾液，該步驟重復3次；

（6）向濾管中再次加入50 mmol/L的TEAB溶液200 μL，室溫下以轉(zhuǎn)速12 000 r/min離心5 min，棄掉濾液，再重復3次；

（7）然后樣品∶酶=50∶1的質(zhì)量比在超濾管中加入胰蛋白酶，在37℃水浴條件下恒溫酶解16 h；酶解結(jié)束后，4℃條件下以轉(zhuǎn)速12 000 r/min離心10 min，收集濾液，凍干得到可用于色譜的樣品。

采用超高分辨率質(zhì)譜儀對分級得到的樣品進行數(shù)據(jù)采集。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

所有試驗均做3次重復。采用SPSS 21.0進行顯著性分析。通過單因素方差分析來比較差異性（p<0.05），根據(jù)方差齊性檢驗結(jié)果選擇LSD和Dunnet'C法進行多重比較。試驗的所有數(shù)據(jù)圖均使用Origin 9.1軟件繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 林蛙卵蛋白的溶解性分析

pH值和溫度對林蛙卵蛋白溶解性的影響見圖1。

圖1 pH值和溫度對林蛙卵蛋白溶解性的影響

在溫度一定的條件下，林蛙卵蛋白的溶解性在pH值為4時處達到最低值，推測此處為林蛙卵蛋白的等電點附近，凈電荷值約為0。在遠離pH值4的酸堿環(huán)境下，林蛙卵蛋白的溶解性有所上升，但未達到80%。pH值條件恒定時，改變環(huán)境溫度，發(fā)現(xiàn)林蛙卵蛋白在20～80℃范圍內(nèi)隨溫度升高而呈上升趨勢，80℃條件下氮溶解指數(shù)接近100%。

2.2 林蛙卵蛋白的持水性分析

溫度和pH值對林蛙卵蛋白持水性的影響見圖2。

圖2 溫度和pH值對林蛙卵蛋白持水性的影響

在pH值11，反應時間30 min的條件下，林蛙卵蛋白的持水性在30～60℃內(nèi)先上升后下降并趨于平緩。當溫度在30～40℃時，林蛙卵蛋白的持水性隨著溫度的升高而增大，在40℃時，持水性最佳達到5.93 g/g；繼續(xù)升高溫度時，蛋白質(zhì)分子三級結(jié)構(gòu)可能發(fā)生變化，鎖住水分子的能力減弱，溶解性上升，因此持水性表現(xiàn)為下降[14]。在室溫，反應時間30 min的條件下，卵蛋白持水性在pH值3～11的范圍內(nèi)呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。當pH值在等電點（pH值4.5）附近時，蛋白質(zhì)分子本身呈現(xiàn)電中性，蛋白質(zhì)分子間相互締合收縮，持水性最低為5.576 g/g。

2.3 林蛙卵蛋白的起泡性分析

pH值對林蛙卵蛋白起泡性的影響見圖3。

圖3 pH值對林蛙卵蛋白起泡性的影響

在蛋白質(zhì)量分數(shù)1%的條件下，林蛙卵蛋白的起泡性在pH值8～11范圍內(nèi)呈增強的趨勢，原因可能是隨著越來越接近蛋白的最適溶解pH值，參與攪打成膜的蛋白質(zhì)分子增多，更多的蛋白分子吸附到氣-液界面，而蛋白質(zhì)分子間也更易相互結(jié)合，從而形成更多的泡沫。而蛋白的起泡穩(wěn)定性較差可能與樣品整體溶解度較低有關(guān)[15]。

2.4 林蛙卵蛋白的乳化性分析

蛋白質(zhì)量濃度對林蛙卵蛋白乳化性的影響見圖4。

圖4 蛋白質(zhì)量濃度對林蛙卵蛋白乳化性的影響

在室溫、pH值11的條件下，在0.1%～0.5%范圍內(nèi)，林蛙卵蛋白的EAI值隨質(zhì)量濃度升高而減小，與扁桃仁蛋白[16]具有類似的乳化特性。這可能是由于在較低的蛋白濃度下，分子擴散系數(shù)較大，有利于新液滴在O/W界面的形成，因此EAI值較高；而在較高的蛋白濃度下，蛋白分子遷移受到阻止，可能降低蛋白吸附的有效性，導致EAI下降。而乳化穩(wěn)定性呈上升趨勢可能是因為液滴尺寸減小，從而使界面蛋白濃度增加，有效地阻止了液滴間的絮凝。

2.5 林蛙卵蛋白的蛋白組分分析

將質(zhì)譜采集到的樣品數(shù)據(jù)用Proteome Discoverer 2.1.0182（Thermo Fisher Scientific，Rockford，IL，USA）進行蛋白質(zhì)鑒定分析，相關(guān)數(shù)據(jù)處理參數(shù)設置如下：

搜庫引擎：Sequest HT；蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫：（TaxId：10090；網(wǎng)址https://www.uniprot.org/uniprot/?query=mouse&sort=score）；Enzyme：Trypsin；Miss Cleavages：2；Variable Modifications：Oxidation(M)，Acetyl(Protein N-term)，Deamidated(N,Q)；Fixed modifications：Carbamidomethyl(C)；Peptide Mass Tolerance：±10 ppm；Fragment Mass Tolerance：±0.02 Da；Peptide FDR:Less than 1%；Protein Q Value：Less than 1%。

蛋白質(zhì)相對分子量分布圖見圖5。

圖5 蛋白質(zhì)相對分子量分布圖

整理數(shù)據(jù)結(jié)果可得，林蛙卵蛋白樣品中共包含425種蛋白/肽段，蛋白主要集中在50～200 kDa的分子量區(qū)間，且大部分蛋白是由2～8個特異性肽段組成。從鑒定出的425種蛋白中選取PE值小于3的蛋白（PE=1，2，3，4，5，值越小代表鑒定蛋白可靠性越高），利用Uniprot ID在數(shù)據(jù)庫中查詢其對應的蛋白種類及物種來源等信息。

蛋白質(zhì)相對分子量分布圖見圖5，PE值小于3的蛋白種類見表1。

表1 PE值小于3的蛋白種類

（續(xù)表1）

3 結(jié)論

對林蛙卵中的混合蛋白進行堿溶酸沉法提取，得到的蛋白粉通過生物化學手段測定其功能特性，包括溶解性、持水性、起泡性和乳化性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，林蛙卵蛋白的溶解性較差，在等電點pH值4.5時達到最低值，在pH值>9時和溫度60℃以上時，林蛙卵蛋白的溶解性有顯著增強，NSI值在0.6以上。與之相反，林蛙卵蛋白的持水性良好，在40℃時達到最佳值5.93 g/g，在遠離等電點的pH值下持水性呈上升趨勢。林蛙卵蛋白的起泡能力一般與其溶解性較差有關(guān)，但乳化能力較好，乳化穩(wěn)定性隨質(zhì)量濃度增加而增加。另外，采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對蛋白中的蛋白和多肽種類進行測定，得知林蛙卵蛋白中有約425種蛋白/肽段，與美洲牛蛙、林蛙等有較好的同源性，蛋白種類以酶居多，分子量主要集中在50～200 kDa。為林蛙卵蛋白今后在食品加工中應用奠定了良好的理論基礎(chǔ)。