王連濤，甘云輝，李應(yīng)軍，溫華生

（深圳市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院胃腸外科，廣東深圳 518104）

肝癌是臨床常見(jiàn)的惡性腫瘤[1]。研究表明，自噬參與多種腫瘤的發(fā)生及發(fā)展，如結(jié)直腸癌、舌癌、宮頸癌。自噬是細(xì)胞中一個(gè)極其精細(xì)的過(guò)程，由自噬相關(guān)基因ATG（autophagy-related genes）調(diào)控，目前已有超過(guò)34個(gè)自噬相關(guān)基因從酵母中分離出來(lái)[2]。Ambra1可以調(diào)節(jié)自噬過(guò)程的發(fā)生和發(fā)展，其可促進(jìn)或抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展[3]。Ambra1具有促腫瘤作用，其介導(dǎo)的自噬可保護(hù)腫瘤細(xì)胞；同時(shí)Ambra1還可能通過(guò)調(diào)節(jié)其他信號(hào)通路發(fā)揮抗腫瘤作用。目前該因子在肝癌方面的研究報(bào)道很少。本研究通過(guò)選取肝癌細(xì)胞HepG2做為本研究細(xì)胞系并構(gòu)建shRNA慢病毒，從而探究Ambra1介導(dǎo)自噬對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

1 資料與方法

1.1 重組慢病毒載體的構(gòu)建 Bam HI和Eco RI雙酶切目的基因分別回收shAmbra1組和shAmbra1+3-MA基因片段，再分別克隆于經(jīng)Bam HI和Eco RI雙酶切的慢病毒p PLK/GFP/+Puro載體。

1.2 細(xì)胞分組與處理 shNon組：細(xì)胞分別以相應(yīng)慢病毒載體感染shAmbra1組和shAmbra1+3-MA基因片段后，在無(wú)氨基酸無(wú)血清的EBSS培養(yǎng)液中培養(yǎng)8~12 h；shAmbra1組：細(xì)胞分別以相應(yīng)慢病毒載體感染sh Ambra1+3-MA基因片段后，在無(wú)氨基酸無(wú)血清的EBSS培養(yǎng)液中培養(yǎng)8~12 h；sh Ambra1+3-MA組：細(xì)胞在用無(wú)氨基酸無(wú)血清的EBSS培養(yǎng)液培養(yǎng)前1 h加入3-MA（10 mmol/L），于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的改變。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 細(xì)胞自噬的檢測(cè) 通過(guò)Western blotting法檢測(cè)細(xì)胞自噬蛋白，包括微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-I（LC3-I）、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ（LC3-Ⅱ）、酵母ATG6同源物（Beclin-1）和自噬相關(guān)基因5（ATG5）表達(dá)。

1.3.2 MTS法 檢 測(cè) 細(xì) 胞 增 殖 能 力 shNon組、sh Ambra1組 和shAmbra1+3-MA組 細(xì) 胞 感 染72 h后，在無(wú)氨基酸無(wú)血清的EBSS培養(yǎng)液中培養(yǎng)8~12 h，分別用0.25%胰蛋白酶消化，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液。連續(xù)觀察5 d，計(jì)算細(xì)胞增殖率。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 shNon組、sh Ambra1組和shAmbra1+3-MA組細(xì)胞感染72 h后，在EBSS培養(yǎng)液中培養(yǎng)12 h，采用AnnexinV/FITC檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究中數(shù)據(jù)全部采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行處理；計(jì)量資料采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析、重復(fù)測(cè)量的方差分析以及析因設(shè)計(jì)方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用百分率（%）表示，組間比較采用χ2分析；P＜0.05代表差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組別細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá) shNon組細(xì) 胞 自 噬 相 關(guān) 蛋 白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1和ATG5表達(dá)高于shAmbra1組和shAmbra1+3-MA組，而shAmbra1組細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)高于shAmbra1+3-MA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 不同組別細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)

2.2 不同組別細(xì)胞增殖能力 隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，3組細(xì)胞的增殖能力降低，且shNon組細(xì)胞增殖能力高于shAmbra1組 和shAmbra1+3-MA組，而shAmbra1組細(xì)胞增殖能力高于shAmbra1+3-MA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 不同組別細(xì)胞增殖能力

2.3 不同組別細(xì)胞凋亡能力 隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，3組細(xì)胞的凋亡能力均增大，且shNon組凋亡率小于shAmbra1組 和shAmbra1+3-MA組，而shAmbra1組細(xì)凋亡率小于shAmbra1+3-MA組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 不同組別細(xì)胞凋亡能力

3 討論

近年來(lái)，有研究學(xué)者對(duì)酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中參與自噬調(diào)控的一系列基因進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在肝癌細(xì)胞中Ambra1能夠促進(jìn)自噬過(guò)程的發(fā)生發(fā)展，同時(shí)還可以抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的發(fā)生[5]。本研究表明，細(xì)胞凋亡能力變化趨勢(shì)則與增殖能力變化趨勢(shì)相反。

自噬是細(xì)胞處于生長(zhǎng)環(huán)境惡劣或者缺乏營(yíng)養(yǎng)時(shí)采取的一種自我保護(hù)方式，此時(shí)細(xì)胞主要是通過(guò)分解自己內(nèi)部的營(yíng)養(yǎng)成分并反復(fù)循環(huán)再利用來(lái)維持生存。自噬過(guò)程的發(fā)生主要針對(duì)的是細(xì)胞內(nèi)底物，包括細(xì)胞器以及一些性質(zhì)特殊的蛋白復(fù)合物，最終被溶酶體降解，發(fā)生再循環(huán)。近年來(lái)，研究學(xué)者對(duì)酵母和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中參與自噬調(diào)控的一系列基因進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)[5]，在肝癌細(xì)胞中Ambra1能夠促進(jìn)自噬過(guò)程的發(fā)生發(fā)展，同時(shí)還可以抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

肝癌細(xì)胞HepG2在凋亡誘導(dǎo)劑的刺激下表現(xiàn)出了Ambra1的降解，這種Ambra1的降解效應(yīng)表明Ambra1在肝癌細(xì)胞中可能發(fā)揮著抑制凋亡的作用。并且，LC3-I、LC3-Ⅱ、Beclin-1和ATG5的激活與細(xì)胞凋亡存在密切的相關(guān)性，表明Ambra1降解的原因可能與微管相關(guān)蛋白或自噬相關(guān)蛋白有關(guān)，并且通過(guò)本次研究也進(jìn)一步確認(rèn)了Ambra1介導(dǎo)自噬對(duì)肝癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響與上述蛋白的共同作用有關(guān)。筆者分析認(rèn)為Ambra1作為腫瘤抑制因子參與了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[6]。Ambra1可能通過(guò)調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[7-9]。目前對(duì)于Ambra1抑制腫瘤的機(jī)制，認(rèn)為Ambra1聯(lián)合自噬適配體LC3對(duì)是否有E3連接酶PARKIN的線(xiàn)粒體清除都非常重要，即Ambra1可以通過(guò)介導(dǎo)線(xiàn)粒體自噬抑制腫瘤[10-12]。

綜上所述，在肝癌細(xì)胞HepG2中，腫瘤細(xì)胞通過(guò)自噬抵抗外部環(huán)境給予的壓力，Ambra1在正性調(diào)控自噬的同時(shí)負(fù)性調(diào)控凋亡。因此，Ambra1在肝癌中調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡的機(jī)制可能會(huì)為肝癌的進(jìn)一步治療提供相應(yīng)的理論基礎(chǔ)和研究策略。