葉夢婷，周佩燕

(1.廣州醫(yī)科大學附屬第五醫(yī)院，廣東 廣州 519000；2.廣州市白云區(qū)第三人民醫(yī)院，廣東 廣州 510000)

神經(jīng)母細胞瘤(Neuroblastoma，NB)是兒童最常見的惡性腫瘤之一[1,2]。神經(jīng)母細胞瘤起源于原始的神經(jīng)脊細胞，惡性程度高、進展快、預后差，在早期即容易發(fā)生骨髓轉移和遠處轉移。近年來，盡管對神經(jīng)母細胞瘤的治療方式(包括手術切除、放療、化療以及分子靶向治療等)取得了很大的進展，但是患兒的5年生存率仍低于40%，嚴重威脅患兒的身體健康[3]。因此，我們亟需篩選出神經(jīng)母細胞瘤的關鍵生物學標志物，并闡明其在調(diào)控神經(jīng)母細胞瘤的惡性增殖以及高度侵襲性的生物學機制，進而在基因層面干預腫瘤的惡性進展。

長鏈非編碼RNA(LincRNA)是一種由基因組中非編碼序列轉錄生成的，其核酸序列長度一般大于200個堿基，不具有翻譯成蛋白質的能力[4,5]。研究發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼RNA具有廣泛的組織表達譜，與編碼蛋白質的mRNA相比較，其具有更強的組織和細胞表達特異性。越來越多的研究表明，LincRNA在調(diào)節(jié)惡性腫瘤細胞的增殖能力、侵襲轉移能力等多個方面發(fā)揮重要作用[6,7]。其中，linc00662就是一種能調(diào)控腫瘤細胞惡性進展的關鍵分子標志物，其定位于人類染色體19q11的內(nèi)含子LincRNA，長度為2085bp。近年來，linc00662已被鑒定為各種癌癥中的一種關鍵致癌基因，包括胃癌、肺癌、口腔鱗狀細胞癌等[8-10]。然而，目前尚不清楚LincRNA00662在神經(jīng)母細胞瘤中的表達及生物學效應?；诖?，本研究主要探索LincRNA00662在神經(jīng)母細胞瘤中的表達特性及其與患兒臨床病理特征之間的關系，并進一步研究其對正常背根神經(jīng)節(jié)細胞和神經(jīng)母細胞瘤細胞的增殖能力及侵襲轉移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 組織樣本信息

本研究共收集40對神經(jīng)母細胞瘤組織和配對的正常組織標本，并且對其臨床病理特征進行評價。所有參與本研究的組織樣本均購買于廣州鋮銨生物科技有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

人類神經(jīng)母細胞瘤細胞系(SK-N-SH，IMR-32，Kelly和SH-SY5Y)和正常背根神經(jīng)節(jié)(DG)細胞均從中國上海公司ATCC獲得。將細胞系培養(yǎng)在含10%胎牛血清的McCoy’s5a培養(yǎng)基中(Gibco,Grand Island,NY ,USA)以37 ℃、5%CO2的環(huán)境培養(yǎng)。

1.3 RNA干擾

我們采用小RNA干擾技術(siRNA)以及脂質體3000轉染試劑(美國Thermo Fisher) 構建linc00662表達下調(diào)的神經(jīng)母細胞瘤細胞系 (siRNA-1和siRNA-2三組)。同時用相應的陰性對照(NC)序列(si-Control) 轉染細胞系。

1.4 實時定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)檢測

首先，用試劑TRIzol (Invitgen，USA)從冰凍組織和細胞系中提取總RNA，然后用PrimeScript RT Master Mix(T Akara)轉錄成cDNA。隨后，使用試劑盒SYBR PreMix Ex T AQ II Kit(T Akara)分析linc00662的表達。并以β-肌動蛋白作為內(nèi)源性對照。本研究使用的引物下所示：linc00662,5’-CAC GCT TCT GAA ACT GGT GT-3’,5’-TGT ACA GCC TGG TGA CAG AG-3’; β-actin,5’-CGC TCT CTG CTC CTC CTG TTC-3’,5’-ATC CGT TGA CTC CGA CCT TCA C -3’.

1.5 CCK-8測定

首先，收集linc00662基因敲低的SH-SY5Y細胞株，以適當?shù)臐舛?5×103個細胞/孔)接種于96孔板中。培養(yǎng)24、48、72、96h后，在McCoy's 5a培養(yǎng)基(CCK-8，Dojindo)中，每孔加入含10%CCK-8溶液100 μL。最后，使用微型平板讀取器(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)讀取每孔的OD值。

1.6 流式細胞儀分析

本研究為了對神經(jīng)母細胞瘤細胞周期進行分析，采用細胞周期檢 測試劑盒(Keygen,Nanjing,China)進行處理。并且我們采用FACSCantoII流式細胞儀(BD Biosciences)檢測處于細胞的細胞周期階段細胞百分比。

1.7 細胞遷移和侵襲性分析

本研究為了評估細胞遷移，我們將收集處理后的細胞用無血清培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，并將4×104細胞加入培養(yǎng)基 (0.8 μm; Corning,NY ,USA) 的上層并且在下層中加入含2 0%胎牛血清的McCoy5a培養(yǎng)液500 μL。24 h后用4%多聚甲醛固定細胞，并用試劑0.1% crystal violet染色，最后使用光學顯微鏡成像觀察。

1.8 統(tǒng)計分析

本研究所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(SD)表示，所有實驗至少重復三次。生存資料采用Kaplan-Meier方法進行分析并使用GraphPad Prism軟件(GraphPad Software,San Diego,California,USA)進行曲線擬合分析。所有其他數(shù)據(jù)均采用Student's t-test進行評估。當P<0.05時，差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 臨床表達與臨床參數(shù)相關性

為了進一步探索LINC00662在神經(jīng)母細胞瘤中的生物學調(diào)控作用，我們首先檢測其在神經(jīng)母細胞瘤組織以及外周正常組織中的表達水平。qPCR結果顯示：LINC00662在神經(jīng)母細胞瘤中的表達水平明顯高于外周的正常組織(圖1，***P<0.001)。此外，我們根據(jù)LINC00662的表達水平中位數(shù)將40例患兒標本分為高表達組和低表達組，并進行卡方檢驗，結果顯示：LINC00662高表達往往與腫瘤分化程度低(P=0.008)、腫瘤分期晚(P=0.0267)以及淋巴結侵犯(P=0.011)等有著密切的聯(lián)系(表1)。這提示LINC00662有可能在神經(jīng)母細胞瘤發(fā)生發(fā)展中擔任促癌角色。

表1 LINC00662表達水平和兒童神經(jīng)母細胞瘤臨床病理參數(shù)的關系

圖1 LincRNA00662在神經(jīng)母細胞瘤組織及外周正常組織中的表達水平，***P<0.001

2.2 神經(jīng)母細胞瘤細胞內(nèi)LINC00662的表達水平及LINC00662低表達的細胞模型構建

為證實LINC00662是否與具有神經(jīng)母細胞瘤發(fā)生發(fā)展相關，我們首先檢測神經(jīng)母細胞瘤細胞以及正常背根神經(jīng)節(jié)細胞中LINC00662的表達水平，qPCR結果顯示：相對于正常背根神經(jīng)節(jié)細胞，LINC00662在神經(jīng)母細胞瘤細胞中的表達水平均明顯上調(diào)，其中SH-SY5Y細胞在所有神經(jīng)母細胞瘤細胞中呈現(xiàn)相對高表達狀態(tài)(圖2A)?；诖耍覀兝弥|體轉染技術構建LINC00662低表達的神經(jīng)母細胞瘤細胞株，結果提示：相對于陰性對照組(si-Control)，siRNA轉染組(siRNA-1和siRNA-2)可顯著抑制SH-SY5Y細胞內(nèi)LINC00662的表達水平(圖2B)，這提示LINC00662低表達的SH-SY5Y細胞模型被成功構建，可用于后續(xù)的功能實驗。

注：A.LINC00662在人類神經(jīng)母細胞瘤細胞和正常背根神經(jīng)節(jié)細胞中的表達水平；B.LINC00662低表達的神經(jīng)母細胞瘤細胞株的構建，***P<0.001。

2.3 敲低LINC00662的表達后能顯著抑制神經(jīng)母細胞瘤細胞的增殖能力

無限增殖能力是所有惡性腫瘤的基本生物學特征，因此在本研究中我們通過CCK-8實驗來進一步探索LINC00662對細胞增殖能力的影響，實驗結果顯示：下調(diào)SH-SY5Y細胞中LINC00662的表達后，細胞的增殖水平較對照組顯著明顯減慢(圖3)，這說明敲低細胞內(nèi)LINC00662的表達能顯著抑制神經(jīng)母細胞瘤細胞的增殖能力。

2.4 敲低LINC00662的表達后對神經(jīng)母細胞瘤細胞周期分布的影響

為進一步明確LINC00662對神經(jīng)母細胞瘤細胞惡性增殖能力調(diào)控的作用機制，在本研究中我們利用流式細胞學技術檢測細胞周期分布情況，結果顯示：與對照組相比較，敲低細胞內(nèi)LINC00662的表達后能使得S期細胞的比例明顯下降、而G2/M期的比例明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(圖4)。這提示敲低LINC00662的表達能誘導更多的神經(jīng)母細胞瘤細胞阻滯在G2/M期，進而抑制神經(jīng)母細胞瘤的惡性增殖能力。

2.5 敲低LINC00662的表達后能顯著抑制神經(jīng)母細胞瘤細胞的侵襲及轉移能力

為了進一步探究LINC00662對神經(jīng)母細胞瘤細胞侵襲轉移能力的影響，在本研究中我們還進行了Transwell實驗，結果顯示：與對照組相比較，siRNA-1和siRNA-2組的細胞侵襲與轉移數(shù)目均顯著減少(圖5)，這說明敲低LINC00662表達后能顯著抑制細胞的侵襲轉移能力。

注：***P<0.001。

si-ControlsiRNA-1siRNA-2100080060040020001000800600400200010008006004002000204060801002000si-ControlsiRNA-1siRNA-26040200CellcycledistributionG1G2/MSDpG1DpG2DpSDpG1DpG2DpSDpG1DpG2DpS***********204060801002000204060801002000

注：***P<0.001。

3 討 論

神經(jīng)母細胞瘤是嬰兒與兒童最常見的顱外實體腫瘤[3]。近年來，隨著社會經(jīng)濟水平的提高和人們生活方式的改變，兒童的神經(jīng)母細胞瘤的患病率呈逐年增加的趨勢，已經(jīng)成為威脅兒童生命安全的重要疾病[11]。在日常診療中，神經(jīng)母細胞瘤起病隱匿、早期癥狀不明顯、極易發(fā)生遠處轉移[12]，盡管神經(jīng)母細胞瘤的的早期篩查、診斷及治療方面取得了較明顯的進展，但患兒的5年生存率仍處于較低的水平。其實，腫瘤的惡性演變過程是一個多因素、長期累積突變的過程，闡明其發(fā)生機制可能為兒童神經(jīng)母細胞瘤的治療帶來新的希望。隨著高通量測序技術及分子生物學的進步，尋找神經(jīng)母細胞瘤的關鍵調(diào)控靶標成為了可能，這將為臨床決策提供關鍵性的指導作用。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA在染色體構象、轉錄和轉錄后調(diào)控等多個過程起著關鍵的調(diào)控作用，并參與惡性腫瘤的增殖、周期和侵襲轉移等生物過程[13]。隨著對長鏈非編碼RNA分子研究的不斷深入，我們發(fā)現(xiàn)許多LincRNA的表達具有高度的組織特異性，有望成為惡性腫瘤的潛在生物學標志為，具有巨大的應用前景[14,15]。其中，linc00662是一個新近發(fā)現(xiàn)的調(diào)控分子，主要定位于人類染色體19q11的內(nèi)含子上。Wang等人發(fā)現(xiàn)LINC00662在脊髓瘤的惡性進展中起著重要的調(diào)控作用，其主要通過調(diào)控miR-16-5p/RNF44B信號軸促進脊髓瘤細胞增殖、集落形成以及侵襲轉移的發(fā)生[16]。此外，Yao等人發(fā)現(xiàn)抑制細胞內(nèi)LINCRNA00662的表達后，能通過調(diào)控miR-145/c-myc軸抑制結直腸癌細胞的增殖能力、誘導更多的結直腸癌細胞發(fā)生凋亡[17]。然而，迄今為止，LINC00662在神經(jīng)母細胞瘤中的表達方式和生物學功能尚不清楚，有待進一步的探索。

基于此，為明確LINC00662在神經(jīng)母細胞瘤中的生物學調(diào)控作用，在本研究中我們首先通過RT-qPCR技術檢測并分析了40例配對的兒童神經(jīng)母細胞瘤組織及外周正常組織標本中LINC00662的表達水平，結果發(fā)現(xiàn)神經(jīng)母細胞瘤組織中LINC00662的表達水平明顯高于癌旁正常組織。此外，統(tǒng)計學結果也一致表明，LINC00662的高表達狀態(tài)往往預示著患兒腫瘤分化程度低、腫瘤分期晚以及淋巴結侵犯。由此可進一步推測，對于神經(jīng)母細胞瘤患兒，LINC00662的表達水平越高意味著患兒的預后差、死亡率高，這提示LINC00662有可能在神經(jīng)母細胞瘤中起促癌作用。

為進一步明確LINC00662的生物學作用，我們通過脂質體轉染技術成功構建了LINC00662過表達的神經(jīng)母細胞瘤細胞模型。研究結果提示，抑制細胞內(nèi)LINC00662的表達后能顯著抑制神經(jīng)母細胞瘤細胞的增殖能力，但其機制尚不明確。既往研究發(fā)現(xiàn)，LincRNA的表達調(diào)控能通過誘導細胞增殖周期阻滯進而影響細胞增殖水平[18-19]。Li等研究人員發(fā)現(xiàn)lncRNA CASC11能通過調(diào)控miR-340-5p/CDK1信號軸，進而誘導細胞周期阻滯，抑制胃癌細胞增殖[20]。因此，在本研究中，我們通過流式細胞學技術檢測細胞周期的分布情況。有趣的是，研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)細胞內(nèi)LINC00662能誘導更多的神經(jīng)母細胞瘤細胞阻滯在G2/M期，進而發(fā)揮細胞增殖抑制效應。同時，侵襲轉移特性強是神經(jīng)母細胞瘤細胞的重要生物學特征。因此，在本研究中，我們利用Transwell實驗探索LINC00662對神經(jīng)母細胞瘤細胞侵襲轉移能力的影響，結果發(fā)現(xiàn)敲低細胞內(nèi)LINC00662的表達能顯著抑制細胞侵襲轉移能力。

綜上所述，LINC00662在神經(jīng)母細胞瘤中呈高表達狀態(tài)，下調(diào)其的表達能通過誘導細胞周期阻滯、抑制細胞增殖能力以及侵襲轉移能力，進而發(fā)揮抑癌作用。LINC00662有望成為神經(jīng)母細胞瘤治療的潛在預測指標及治療靶點，通過干擾其表達能最大程度的改善神經(jīng)母細胞瘤患兒的臨床預后。