張 諾, 陳 立, 謝廣林

(1. 長江大學 農(nóng)學院，湖北 荊州 434025；2. 河北大學 生命科學學院，生命科學與綠色發(fā)展研究院，河北 保定 071002)

昆蟲通?？舍尫哦嘟M分信息素，而這些信息素的結(jié)構(gòu)往往十分相近[1]，大多是長鏈不飽和的醇、羧酸、酯、酮或烯烴類化合物，并存在大量的異構(gòu)體。此外，兩種或兩種以上近緣種昆蟲利用同一種化學物質(zhì)作為信息素的情況并不罕見。這些昆蟲能通過不同信息素成分或主、次要成分間比例的不同，尤其是順反異構(gòu)體間比例的差異，來區(qū)分彼此。例如：棉鈴蟲Helicoverpa armigera和煙青蟲Heliothis assulta同屬于鱗翅目重要害蟲，棉鈴蟲體內(nèi)的順-11-十六碳烯醛與順-9-十六碳烯醛質(zhì)量比為96:4，而煙青蟲體內(nèi)二者的質(zhì)量比為4 : 96，棉鈴蟲和煙青蟲可通過含有相反比例的順-11-十六碳烯醛和順-9-十六碳烯醛，達到種間生殖隔離的目的[2]。歐洲玉米螟Ostrinia nubilalis的信息素有兩種類型：順式型由質(zhì)量比為97% ～ 99%的順-11-十四碳烯醇乙酸酯及1% ～3%的反-11-十四碳烯醇乙酸酯組成；反式型則由1% ～ 3% 的順-11-十四碳烯醇乙酸酯及97% ～99%的反-11-十四碳烯醇乙酸酯組成[3-4]。

昆蟲信息素在昆蟲體內(nèi)的含量極低，通常利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用 (GC-MS) 技術(shù)進行初步鑒定，然后通過化學合成進行結(jié)構(gòu)驗證[5]。昆蟲信息素的化學合成常依賴于Wittig 反應，在合成過程中通常會形成順、反異構(gòu)體，使產(chǎn)物的分離純化變得復雜[6]。在昆蟲信息素的實際應用中，有時候異構(gòu)體的存在會對信息素有效成分產(chǎn)生拮抗作用，從而導致信息素生物活性降低甚至完全失效[7-8]，但有時又必須加入適量的異構(gòu)體才能獲得最佳的引誘效果[9]。因此，在昆蟲信息素的鑒定、合成及生物活性測試中，順、反異構(gòu)體的分離尤為重要。

硝酸銀-硅膠分離技術(shù)能利用銀離子的絡合能力有效分離含有雙鍵的異構(gòu)體，在不飽和酯、醛和碳氫化合物的分離上應用廣泛[6]。此外，在昆蟲信息素的鑒定和合成過程中，利用硝酸銀-硅膠分離技術(shù)可以快速高效地分離順、反異構(gòu)體[10-12]。目前國內(nèi)外尚未見硝酸銀-硅膠分離技術(shù)在昆蟲信息素研究方面的相關綜述，鑒于此，本文擬對硝酸銀-硅膠分離技術(shù)的原理、制備方法及影響因素進行詳細介紹，總結(jié)應用該方法成功分離的昆蟲信息素的結(jié)構(gòu)特征，旨在為昆蟲信息素的分離、純化提供參考方法。

1 硝酸銀-硅膠分離技術(shù)

1.1 原理及特點

20 世紀30 年代末，Lucas 研究組發(fā)現(xiàn)銀離子與烯烴之間的絡合反應是可逆的，并能快速達到平衡[13-14]，其平衡常數(shù)的對數(shù)值與烯烴的氫化熱呈線性關系，即銀離子-烯烴配合物的穩(wěn)定性隨烯烴自由能常數(shù)的增加而增加[15]。 Scholfield 等[16]在使用逆流分配法分離油酸甲酯和亞麻酸甲酯的過程中發(fā)現(xiàn)，利用銀離子與雙鍵之間的絡合作用在不飽和化合物分離方面存在巨大潛力。從此，硝酸銀被摻入到硅膠吸附劑中用于不飽和脂類及醇類化合物的定性、定量分析或制備分離[16-19]。例如，已成功用于分離含不同雙鍵數(shù)和幾何構(gòu)型的脂肪酸甲酯和甘油三酯[20-23]。此后，高效液相色譜泵的應用進一步促進了硝酸銀-硅膠分離技術(shù)的發(fā)展，并實現(xiàn)了快速、高效的制備分離[24-26]。

硝酸銀可以改變硅膠表面的吸附性能，吸附在硅膠上的銀離子與不飽和鍵之間發(fā)生了電子轉(zhuǎn)移，在π 鍵上形成了銀離子配合物，從而改變了分配系數(shù)[27]。不含雙鍵或雙鍵數(shù)目較少的化合物與硅膠之間的吸附作用較弱，更易被洗脫，進而使飽和度不同的化合物得以分離?；衔锱c硝酸銀-硅膠之間吸附作用的強度與其碳鏈的長度和碳鏈上的雙鍵數(shù)目有關。在具有一定極性的洗脫劑中，化合物的碳鏈越短，雙鍵數(shù)目越多，吸附作用力越強；反之越弱。根據(jù)這種特性，可以將具有不同雙鍵數(shù)目和碳鏈長度的不飽和化合物分離開來。另外，硝酸銀-硅膠對順式異構(gòu)體的吸附力要強于對反式異構(gòu)體的吸附力，因而可以將順、反異構(gòu)體分開[28]。

1.2 硝酸銀-硅膠分離技術(shù)與硅膠層析分離技術(shù)在昆蟲信息素分離中的優(yōu)缺點比較

硅膠吸附劑具有分離效率高、分辨率高、分析時間短、峰容量高等優(yōu)點，適用于極性差異很小的多組分混合物的分離[29]。常規(guī)硅膠柱層析分離技術(shù)是利用物質(zhì)在硅膠柱上的吸附力差異將不同的物質(zhì)分離開來，極性弱的物質(zhì)不易被硅膠吸附而易被洗脫，極性強的物質(zhì)易被吸附而不易被洗脫。雖然常規(guī)硅膠柱層析分離技術(shù)操作簡單，應用廣泛，但是無法將烯烴異構(gòu)體分開。

昆蟲信息素多數(shù)由兩種以上組分組成，且多含不飽和烴[30]，硝酸銀-硅膠分離技術(shù)正是利用不飽和化合物與銀離子之間絡合作用的強弱不同而將物質(zhì)分離開來，在分離飽和與不飽和的組分、順式和反式異構(gòu)體上具有較明顯的優(yōu)勢。

1.3 硝酸銀-硅膠的制備及其分離效果影響因素

1.3.1 制備方法 根據(jù)樣品含量稱取適量的層析用硅膠，加入到含有硝酸銀的水溶液中 (硝酸銀質(zhì)量分數(shù)一般為5%～20%) ，水溶液需將硅膠完全浸沒，充分攪拌，外包錫箔紙避光靜置約2 h，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓蒸干，直至外層錫箔紙完全變黑。將所得硝酸銀-硅膠轉(zhuǎn)至玻璃器皿中，于120℃烘箱中活化12 ～ 15 h，最后轉(zhuǎn)移到棕色瓶內(nèi)，于低溫干燥處避光保存[31-34]。硝酸銀-硅膠層析柱的填充方法與普通硅膠層析柱相同，但硝酸銀-硅膠層析柱需避光處理[32]。

1.3.2 分離過程及結(jié)果分析 在上樣前，先利用硝酸銀-硅膠薄層層析探索柱層析的洗脫條件，即利用常規(guī)方法在硝酸銀-硅膠薄層層析板上點樣、展缸中展開、合適的顯色劑顯色，根據(jù)樣品成分的比移值 (Rf) 確定洗脫條件。從硝酸銀-硅膠層析柱上洗脫下來的組分，再經(jīng)硝酸銀-硅膠薄層層析，根據(jù)Rf值確定是否為同一種物質(zhì)。將含有同一物質(zhì)的組分合并，通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、核磁共振、紅外光譜和高分辨質(zhì)譜來確定其結(jié)構(gòu)。

1.3.3 影響硝酸銀-硅膠分離效果的因素 采用硝酸銀-硅膠分離化合物時，硅膠顆粒的大小、所用溶劑的極性、上樣量、Ag+濃度及待分離化合物烯烴的取代程度都是影響分離效果的直接因素。

1.3.3.1 硅膠顆粒的大小 硅膠顆粒直徑越小，比表面積越大，所填層析柱的分離效果越好。但如果硅膠顆粒直徑過小，層析柱中洗脫劑的流出速度過慢，反而會影響化合物分離的效果[35]。

1.3.3.2 溶劑極性 在一定極性的洗脫劑中，碳鏈越長，雙鍵數(shù)越少，不飽和化合物分子與Ag+的吸附作用就越弱，就越容易被洗脫；反之則不易被洗脫。與Ag+吸附作用較弱的物質(zhì)可以用極性較弱的洗脫劑洗脫，但與Ag+吸附作用較強的物質(zhì)則需要用極性較強的洗脫劑洗脫[36]。

1.3.3.3 上樣量 與常規(guī)硅膠柱層析分離技術(shù)一樣，上樣量的多少也會影響硝酸銀-硅膠分離技術(shù)的分離效果。硝酸銀-硅膠柱分離實際上是一種制備型液相色譜。這種制備色譜區(qū)別于分析型色譜的一個重要特點就是上樣量往往是適當過載的，即在非線性的條件下進行制備性分離。但當色譜柱嚴重過載時，色譜柱的柱效會呈指數(shù)下降，導致失去分離能力[36]。

1.3.3.4 烯烴的取代模式 硝酸銀-硅膠分離法特別適用于分離取代模式不同的烯烴，烯烴的取代模式?jīng)Q定了其在硝酸銀-硅膠柱上的洗脫順序。不飽和烯烴與硝酸銀-硅膠柱里面Ag+結(jié)合能力的順序為：RCH=CH2>R2C=CH2>R2C=CHR>R2C=CR2[37]，即雙鍵上的取代度越高，其結(jié)合能力越弱，可被優(yōu)先洗脫；而取代度越低的烯烴，結(jié)合能力越強，后被洗脫下來，從而達到將取代模式不同的烯烴化合物分離的目的。

1.3.3.5 Ag+濃度 通過化合物的絡合能力來確定能達到最佳分離效果的Ag+的濃度。雙鍵的數(shù)量決定了化合物與Ag+的絡合能力，雙鍵數(shù)越多，絡合能力越強。通過比較不同濃度的Ag+(15、50、100 和150 mmol/L) 分別對(Z,E) -7-十二碳烯乙酸酯、(Z,E) -7-十六碳烯乙酸酯、(Z,E) -11-十六碳烯乙酸酯、(Z,E) -7-十二碳烯醇、(Z,E) -8-十二碳烯醇、(Z,E) -9-十二碳烯醇、(Z,E) -11-十四碳烯醇、法尼醇及法尼烯的分離效果發(fā)現(xiàn)，使用100 mmol/L的硝酸銀可以最大程度地分離單不飽和幾何異構(gòu)體和位置異構(gòu)體，使用50 mmol/L 的硝酸銀可以最好地分離雙不飽和異構(gòu)體，15 mmol/L 硝酸銀對多不飽和化合物的選擇性最高[38]。比較質(zhì)量分數(shù)不同 (3%、5%、7%及10%) 的硝酸銀的分離效果發(fā)現(xiàn)，5%硝酸銀-硅膠柱可以完全分離3,13-十八碳二烯-1-醇乙酸酯的4 個異構(gòu)體[11]。

2 硝酸銀-硅膠分離技術(shù)在昆蟲信息素研究中的應用

2.1 不飽和脂肪醇、醛和酯類性信息素

昆蟲性信息素中，含羥基、醛基和酯基的分子結(jié)構(gòu)較多，如鱗翅目昆蟲的性信息素主要為含有10～18 個碳的直鏈烷烴的醇、醛或酯[39]，多用硝酸銀-硅膠分離技術(shù)分離在合成過程中產(chǎn)生的順、反異構(gòu)體 (表1) 。

馬尾松毛蟲Dendrolimus punctatus性信息素為5,7-十二碳二烯醇乙酸酯，有4 個異構(gòu)體，分別為(Z,Z)-5,7-十二碳二烯醇乙酸酯、(Z,E)-5,7-十二碳二烯醇乙酸酯、(E,Z)-5,7-十二碳二烯醇乙酸酯和(E,E)-5,7-十二碳二烯醇乙酸酯。鄭如玉等[40]利用TLC (20%硝酸銀-硅膠G 薄層板) 為高效液相色譜(HPLC)中的硝酸銀-硅膠柱找到較好的流動相—V(二氯甲烷) :V(己烷)=1 : 1 或1 : 2 (體積分數(shù)為90% ～ 95%) 和體積分數(shù)為5%～10% 的乙醚，該流動相可完全分離這4 種順、反異構(gòu)體。通過Wittig 反應可以合成馬尾松毛蟲性信息素的前體化合物—(Z,E)-5,7-十二碳二烯-1-醇，利用硝酸銀-硅膠柱層析可將目標產(chǎn)物—(Z,E)-5,7-十二碳二烯-1-醇與其異構(gòu)體—(E,E)-5,7-十二碳二烯-1-醇分離[41-43]。

小蔗螟Diatraea saccharalis信息素腺體含有十六醛、(Z)-十六碳-11-烯醛和9,11-十六碳二烯醛的4 種幾何異構(gòu)體，在合成(Z,Z)和(Z,E)-9,11-十六碳二烯醛時，使用硝酸銀-硅膠分離中間體，再經(jīng)重鉻酸吡啶氧化得到純的性信息素成分[44]。

以戊二醇和己二醇為起始原料合成梨小食心蟲Grapholitha molesta性信息素——(Z)-8-十二碳烯醇乙酸酯，所得順、反異構(gòu)體用硝酸銀-硅膠薄層層析或?qū)游鲋M行分離，可得順(Z)-8-十二碳烯醇乙酸酯及其反式異構(gòu)體[9]；以癸二醇為起始原料合成歐洲玉米螟性信息素——順-11-十四碳烯醇乙酸酯和反-11-十四碳烯醇乙酸酯，終產(chǎn)物用含18%硝酸銀的硅膠柱層析分離，可得純度達98%的順-11-十四碳烯醇乙酸酯和純度達99%的反-11-十四碳烯醇乙酸酯[45]；棉紅鈴蟲Pectinophora gossypiella的性信息素為10-丙基-反-5,9-十三碳烯醇乙酸酯[46]，用四亞甲基-l,4-雙三苯基溴化磷與4-庚酮和5-乙酰氧基戊醛反應得到順-和反-10-正丙基-反-5,9-十三碳二烯基乙酸酯，順、反異構(gòu)體混合物經(jīng)硝酸銀-硅膠柱層析分離，用V(正己烷) :V(乙醚)=97 : 3 的溶劑為洗脫劑，得到反式異構(gòu)體[47]；在合成棉褐帶卷葉蛾Adoxophyes orana性信息素時，采用硝酸銀-硅膠柱對產(chǎn)物進行分離，可以得到純度高達99%的(Z)-9-十四碳烯醇乙酸酯和(Z)-11-十四碳烯醇乙酸酯[48]；以1,8-辛二醇為原料合成蘋果小卷蛾Laspeyresia pomonella性信息素成分(Z)-9-十四碳烯醇乙酸酯，所得產(chǎn)物中順式異構(gòu)體純度達98%，采用硝酸銀-硅膠薄層層析 (展開劑為V(石油醚) :V(乙酸乙酯)=85 :15) 分離，可得(Z)-9-十四碳烯醇乙酸酯[49]；在合成黃地老虎Agrotis segetum性信息素順-5-十碳烯-1-醇乙酸酯時，用硝酸銀-硅膠柱分離，目標異構(gòu)體的純度高達99%[50]。

2.2 不飽和直鏈烴性信息素

昆蟲性信息素成分中有許多不飽和烴。Doi 等[51]為了鑒定嗜鳳梨果蠅Drosophila ananassae的性信息素成分，對果蠅表皮的碳氫化合物進行了分析和生物測定，經(jīng)硅膠和硝酸銀-硅膠層析分離得到(Z,Z)-5,25-三十一碳二烯和(Z,Z)-4,26-三十一碳二烯，發(fā)現(xiàn)這兩種碳氫化合物都能誘導雄性求偶行為；松樹蜂Sirex noctilo雌蟲角質(zhì)層上的化合物可以誘導同種雄蟲的交配行為，用正己烷浸提雌蟲角質(zhì)層，浸提液經(jīng)硝酸銀-硅膠分離其中的飽和烴和不飽和烴，通過質(zhì)譜鑒定出引起雄蟲交配反應的性信息素組分為(Z)-7-二十七烯、(Z)-7-二十九烯和(Z)-9-二十九烯[52]。

2.3 萜烯類性信息素和跟蹤信息素

紅帶袖蝶Heliconius melpomene雄蟲在交配過程中會將抑性欲素 (anti-aphrodisiac pheromone) 轉(zhuǎn)移到雌蟲身上，導致雌蟲對其他雄蟲產(chǎn)生排斥反應，這種信息素主要由(E)-β-ocimene ((E)-2,6-二甲基-2,5,7-三烯辛烷) 和一些微量成分組成[53]。為確認(E)-β-ocimene 的結(jié)構(gòu)，Schulz 等[53]按照Matsushita 等[54]的方法制備了質(zhì)量比為7 : 3 的(Z)- 和(E)-ocimene 混合物，后用硝酸銀-硅膠分離技術(shù)將(E)-ocimene 的純度提高。未交配的桃仁蜂Eurytoma amygdali雌蟲對雄蟲有強烈的吸引力，Krokos 等[55]在探索雌蟲分泌性信息素的具體部位時，采用硝酸銀-硅膠分離技術(shù)分離其表皮化合物，其中烷烴首先被洗脫下來，其次是烯烴，最后是二烯烴，經(jīng)實驗室生物測定后發(fā)現(xiàn)，雌蟲分泌的(Z,Z)-6,9-二十三碳二烯和(Z,Z)-6,9-二十五碳二烯及少量烯烴對雄蟲具有吸引效果 (表1) 。

Vander Meer 等[56]對紅火蟻Solenopsis invicta的跟蹤信息素進行了鑒定，發(fā)現(xiàn)含有(Z,E)-α-法尼烯、(E,E)-α-法尼烯、(Z,E)-α-高法尼烯和(E,E)-α-高法尼烯4 種構(gòu)型，之后其在合成紅火蟻跟蹤信息素的過程中，使用含10% 硝酸銀的硅膠柱層析，可將高法尼烯的順、反異構(gòu)體成分完全分離[57]。Williams 等[58-59]在對螞蟻杜氏腺分泌物進行鑒定的過程中，證實Z,Z,Z-異法尼烯是紅火蟻跟蹤信息素的有效成分，對其進行合成，產(chǎn)生了8 種異構(gòu)體，其中E,E,E-異法尼烯、Z,E,E-異法尼烯、E,E,Z-異法尼烯和Z,E,Z-異法尼烯這4 種異構(gòu)體較穩(wěn)定，可用氣相色譜法直接分離，而不穩(wěn)定的Z,Z,Z-異法尼烯、E,Z,Z-異法尼烯、Z,Z,E-異法尼烯和E,Z,E-異法尼烯則需在含有20% 硝酸銀的RSil 柱上分離。以甲基環(huán)丙基酮和6-甲基-5-烯-2 酮為原料，經(jīng)Wittig 反應得到紅火蟻的跟蹤信息素成分(Z,E)-α-法尼烯及其異構(gòu)體(Z,Z)-α-法尼烯，在合成的最后階段，利用含20% 硝酸銀-硅膠的中壓色譜可將這兩種法尼烯異構(gòu)體分離[60](表1) 。

2.4 聚集信息素

硝酸銀-硅膠分離技術(shù)在聚集信息素的研究中也多有應用 (表1) 。雄性闊角谷盜Gnatocerus cornutus可產(chǎn)生微量的聚集信息素，將350 萬頭雄蟲的揮發(fā)物加到5%的硝酸銀-硅膠柱上，然后進行氣相色譜分析，發(fā)現(xiàn)主要信息素成分為菖蒲二烯(acoradiene)[61]。(Z)-5,13-十四烯基乙酸酯為木蠹蛾Chilecomadia valdiviana幼蟲的聚集信息素，以十二烷-1-醇為起始原料，在經(jīng)Wittig 反應的合成過程中產(chǎn)生質(zhì)量比為94 : 6 的順、反異構(gòu)體混合物，經(jīng)硝酸銀-硅膠柱層析分離純化[62]。(S,Z)-十二碳-3-烯-11-內(nèi)酯為銹赤扁谷盜Cryptolestes ferrugineus的聚集信息素，以6-溴-1-己醇為起始原料，經(jīng)Wittig 反應構(gòu)建了關鍵的順式雙鍵，然后通過光延反應合成(S,Z)-十二碳-3-烯-11-內(nèi)酯，所得粗產(chǎn)物經(jīng)常規(guī)硅膠柱層析純化后，再用硝酸銀-硅膠柱層析對順式和反式異構(gòu)體進行分離[63]。

表1 利用硝酸銀-硅膠分離技術(shù)分離的昆蟲信息素Table 1 The insect pheromones separated by silver nitrate-silica gel separation technique

3 討論與展望

昆蟲信息素具有無毒、無害和種屬特異性等特點，利用昆蟲信息素可進行高效、無污染、可持續(xù)的害蟲治理[64]。昆蟲信息素一般含量極低，可采用有機溶劑浸泡法、冷凝法、動態(tài)頂空吸附法、固相微萃取法等方法提取[65]，但要實現(xiàn)用昆蟲信息素防治害蟲的目的，還需依賴化學合成。一般來說，昆蟲信息素的碳鏈較長，且多為不飽和的醇、醛、酯，有時含多個雙鍵，在全合成過程中，大部分中間體可使用常規(guī)硅膠柱層析來分離純化，但是終產(chǎn)物多為順、反異構(gòu)體的混合物；此外，昆蟲信息素的合成大多依賴于Wittig反應，易產(chǎn)生不同比例的順、反異構(gòu)體混合物，因此，順、反異構(gòu)體的分離純化在昆蟲信息素的研究中就顯得尤為重要[6]。對于結(jié)構(gòu)較為復雜的昆蟲信息素成分，如藥材甲Stegobium panicem性信息素 ((2S,3R,1R)-2,3,5-三甲基-6-(1-甲基-2-氧代丁基)-4-氧代-氧雜-5-環(huán)己烯)[66]、日本麗金龜Popillia japonica性信息素 ((R,Z)-5-(1-十碳烯基)二氫-2-(3H)呋喃酮)[67]等，在對其鑒定及合成的過程中，可以嘗試使用硝酸銀-硅膠柱層析法進行分離純化。

總體來說，硝酸銀-硅膠分離技術(shù)主要應用于昆蟲信息素順、反異構(gòu)體的分離，能夠相對快速地分離含雙鍵的昆蟲信息素組分，在昆蟲信息素的研究中扮演重要角色。隨著科學研究的不斷深入，與其他分析技術(shù)相結(jié)合，和先進的科學儀器聯(lián)用，硝酸銀-硅膠分離技術(shù)必將在昆蟲信息素結(jié)構(gòu)與功能等方面得到更廣泛的應用，對害蟲可持續(xù)控制技術(shù)也將發(fā)揮重要支撐作用，更好地推動昆蟲學科的發(fā)展。