謝曉俊, 羊桂英, 周琪歡, 朱婭寧, 莫建初

(浙江大學 昆蟲科學研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)昆蟲學重點實驗室，浙江省作物病蟲生物學重點實驗室，杭州 310058)

納米技術是一門交叉性強的綜合學科，納米材料具有常規(guī)材料所不具備的獨特性質和功能，使其在工程、光電、生物醫(yī)學、環(huán)保、藥理學及可持續(xù)農(nóng)業(yè)等領域的應用備受關注[1-6]。納米材料的制備和研究是整個納米技術的基礎。傳統(tǒng)的化學制備方法具有高能耗、不穩(wěn)定、步驟繁瑣、使用的溶劑毒性強、污染嚴重、對環(huán)境和非靶標生物存在潛在危害等弊端[7]，使得研究者逐步將研究重點轉向綠色合成[8]。金屬納米被認為是生物醫(yī)學、農(nóng)業(yè)研究等領域最具有發(fā)展前景的納米顆粒之一[9]。在金屬納米材料中，以納米銀(AgNPs)的研究最為深入。納米銀的綠色合成主要是利用真菌、細菌培養(yǎng)上清液以及植物提取物的某些組分或純代謝物作為還原劑和穩(wěn)定劑，將硝酸銀中的Ag+還原為納米級別的銀單質[10]。與傳統(tǒng)制備方法相比，綠色合成方法操作簡單、成本低，不需要使用有毒化學物質，并且有助于降低能耗，推進環(huán)境可持續(xù)發(fā)展[11]。因此，利用生物源介導合成納米銀成為了目前納米材料合成研究的一大熱點。近年來，有報道稱生物源合成的納米銀具有殺蟲活性?？紤]到傳統(tǒng)殺蟲劑所引起的害蟲耐藥性增加、化學殘留物的積累及對人類健康和環(huán)境的不利影響，新型綠色農(nóng)藥的開發(fā)和應用迫在眉睫。本綜述以納米銀的綠色合成作為切入點，基于近年來國內(nèi)外研究報道，對采用不同生物資源合成納米銀的現(xiàn)狀和合成方法進行了歸納總結，討論了納米銀的殺蟲活性和目前已知的殺蟲作用機理，分析了生物源合成的納米銀對人類健康和生態(tài)環(huán)境的潛在風險，并對未來納米銀的綠色合成可能面臨的機遇和挑戰(zhàn)進行了展望，以期為新型生物源合成納米銀農(nóng)藥的研發(fā)和工業(yè)化生產(chǎn)提供有價值的參考。

1 合成納米銀的生物資源

1.1 微生物

由微生物介導的納米銀的綠色合成包括細胞內(nèi)(生物質)和細胞外(細胞提取物)兩種方式[12]。細胞外合成由于操作簡便，免除了下游回收納米銀的繁瑣程序而受到高度關注[10]。目前利用微生物介導合成的納米銀的研究大多屬于胞外合成，發(fā)揮重要作用的是由菌體分泌產(chǎn)生的胞外酶、還原性輔酶、多肽類及其他次級代謝物質，它們可作為穩(wěn)定劑和還原劑參與金屬離子的還原反應[13]。大多數(shù)微生物具有對金屬的高耐受性及細胞內(nèi)的金屬吸收能力[14]，這一特點增強了微生物與金屬離子的親和力和結合力。另外，微生物不僅易生長、繁殖速度快、還具備高度的可操縱性，具有通過控制菌體培養(yǎng)條件調節(jié)微生物代謝，從而統(tǒng)一優(yōu)化合成納米銀的粒徑、形狀和聚集程度等特性。截至目前，已經(jīng)有幾十種微生物資源被用于合成納米銀，部分最新研究成果列于表1。

表1 AgNPs 綠色合成的微生物資源Table 1 Microbial resources for green synthesis of AgNPs

1.2 植物

植物的各部分中含有多糖、脂質、蛋白質、酶、生物堿、單寧、酚類、皂苷及萜類等化學成分[21]。這些化學分子經(jīng)過重組，在納米銀合成中作為還原劑和穩(wěn)定劑，將硝酸銀溶液中的Ag+還原成納米級別的銀單質。由于植物合成納米銀大多以水作為溶劑，因此合成過程綠色無毒、快速高效[22]。與微生物相比，利用植物合成納米銀不要求無菌條件，降低了培養(yǎng)和維護成本，操作更加簡便，生物危害小，大大提高了工業(yè)生產(chǎn)可行性[21]。這些特點使得植物提取物介導納米銀合成具有極大的發(fā)展前景。截至目前，已有上百種植物資源被用于胞外合成納米銀的研究，部分最新研究成果如表2 所示。

表2 AgNPs 綠色合成的植物資源Table 2 Plant resources for green synthesis of AgNPs

2 納米銀的綠色合成方法

2.1 微生物介導的綠色合成

常用的微生物介導下合成納米銀的流程圖見圖1。

在細胞外合成中，以蠟樣芽孢桿菌Bacillus cereusA1-5 為例，首先將菌液在瓊脂培養(yǎng)基中于35 ℃振蕩(150 r/min)培養(yǎng)120 h 后，以12 000 r/min 離心，收集底部沉淀，用蒸餾水洗滌沉淀以去除培養(yǎng)基的剩余成分。然后取10 g 芽孢桿菌沉淀與100 mL 蒸餾水在30 ℃下混合均勻，72 h后利用Whatman No.1 濾紙過濾混合液，收集濾液；向90 mL、1 mmol/L 的硝酸銀溶液中逐滴滴入10 mL 芽孢桿菌濾液，于30 ℃、150 r/min的黑暗條件下孵育24 h，最終混合液顏色從無色變成黃褐色是納米銀合成的第一個指標；進一步表征結果顯示：納米銀分散良好，呈球形，粒徑在6～50 nm 之間[18]。

2.2 植物提取液介導的綠色合成

基于植物提取液介導合成納米銀的研究，在納米銀綠色合成中占據(jù)重要地位。利用植物合成納米銀的方法 (以臘腸樹果實為例) ：先破果殼收集果肉，室溫干燥后置于烘箱內(nèi)2～3 d，待烘干后磨成粉末，過40 目篩 (孔徑0.425 mm) ；取10 g果肉粉末于100 mL 蒸餾水中 60 ℃浸煮，混合液經(jīng)Whatman No.1 濾紙過濾純化得到果肉濾液，作為合成納米銀的起始材料；向200 mL、3 mmol/L的硝酸銀溶液中逐滴滴入50 mL 提取液，混勻后置于80 ℃水浴中加熱，混合液由無色變成深棕褐色，隨后利用紫外吸收可見光譜儀 (UV-Vis) 掃描出現(xiàn)特征峰 (400～450 nm) ，如圖2 所示，初步確認納米銀的生成[28]；最后通過掃描電鏡 (SEM) 、透射電鏡 (TEM) 、能量色散X 射線光譜儀 (EDX)和傅里葉紅外光譜儀 (FTIR)對納米銀進一步表征，結果如圖3 和圖4 所示[28]，生成的納米銀大多呈球形、粒徑均勻、樣品中銀單質含量較高且官能團多樣。

與微生物介導合成納米銀相比，利用植物合成納米銀的方法更簡便、易操作，原料無毒、可擴展性強，可避免微生物培養(yǎng)過程中有害生物的侵入等問題，節(jié)省了合成成本，更易滿足納米銀在生物醫(yī)學和環(huán)境領域的高需求。因此，目前在納米材料的綠色合成中，利用植物原料合成的研究更廣泛。

3 生物源合成納米銀的殺蟲活性及其作用機理

3.1 生物源合成納米銀的殺蟲活性

目前，生物源合成的納米銀用于害蟲防治的研究主要集中在危害公共衛(wèi)生健康的媒介害蟲和影響經(jīng)濟生產(chǎn)的農(nóng)業(yè)害蟲兩方面。

3.1.1 媒介害蟲 蚊蟲作為媒介害蟲的典型代表，可傳播瘧疾、寨卡、登革熱和黃熱病等疾病。青蒿素在臨床上用于治療瘧疾。據(jù)WHO 報道，部分地區(qū)的臨床數(shù)據(jù)顯示已產(chǎn)生抗藥性[29]。因此，蚊媒疾病仍是全世界人口健康的巨大威脅。目前，對蚊蟲的防控措施主要有物理防治(紗帳)、化學防治(驅蚊劑) 和生物防治(自然天敵)等，但廣泛應用的還是化學防治[30]。

21 世紀以來，隨著生物資源介導合成納米銀工作的開展，一些研究者期望將納米銀應用到危害公共衛(wèi)生健康的蚊媒控制上，先后測試了生物源合成的納米銀對多種蚊蟲幼蟲、蛹和成蟲的毒性。Amerasan 等[31]測定了利用綠僵菌Metarhizium anisopliae制備的納米銀對瘧疾媒介庫態(tài)按蚊Anopheles culicifacies的急性毒性，發(fā)現(xiàn)納米銀對庫態(tài)按蚊幼蟲和蛹的LC50值分別為32.8 mg/L (Ⅰ齡)、39.8 mg/L (Ⅱ齡)、45.9 mg/L (Ⅲ齡)、51.9 mg/L(Ⅳ齡)和60.0 mg/L (蛹)，說明較低劑量的納米銀就會導致庫態(tài)按蚊各齡期的幼蟲和蛹死亡。Govindarajan 等[32]利用白樺葉提取液作為還原劑合成納米銀，發(fā)現(xiàn)其對傳播瘧疾的淺色按蚊Anopheles subpictus、傳播登革熱的白紋伊蚊Aedes albopictus及傳播日本腦炎病毒的三帶喙庫蚊Culex tritaeniorhynchus的三齡幼蟲均有毒性效應， LC50值分別為12.53、13.42 和14.61 mg/L，遠低于白樺葉提取液處理的 LC50值 (61.23、64.97 和70.72 mg/L) ，且在較高濃度下對搖蚊、仰椿和食蚊魚這3 種非靶標生物只有很低的毒性。Kumar 等[33]也發(fā)現(xiàn)，利用止瀉木樹皮合成的納米銀對溫中劍水蚤Mesocyclops thermocyclopoides這一非靶標生物低毒。該團隊還發(fā)現(xiàn)，利用歐洲蕨葉提取液合成的納米銀可降低斯氏按蚊Anopheles stephensi的繁殖能力和壽命，與氯喹相比，對惡性瘧原蟲有更好的抑制效果[34]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，在相同濃度下，用印楝種子仁提取液合成的納米銀對小鼠體內(nèi)伯氏瘧原蟲的抑制效果也分別高于單獨使用印楝種子仁提取液和氯喹的效果，且抗瘧原蟲的活性與劑量呈正相關，即隨著納米銀濃度增加，抗瘧原蟲活性提高[35]。

蠅類具有發(fā)育階段明顯、生命周期短及遺傳結構清晰等特點，也是研究納米銀毒性的理想生物。Ong 團隊[36]發(fā)現(xiàn)，納米銀會降低果蠅睪丸中生殖干細胞的數(shù)量并誘導精子產(chǎn)生缺陷，導致發(fā)育延遲，甚至存活率顯著下降等。Raj 等[37]也發(fā)現(xiàn)，喂食納米銀的黑腹果蠅成蟲的存活率、壽命、卵巢大小和產(chǎn)卵能力均顯著降低，且納米銀的毒效存在跨代效應，即在早期幼蟲階段攝食納米銀會影響下一代。納米銀還會破壞黑腹果蠅幼蟲神經(jīng)干細胞和非神經(jīng)元細胞的遺傳物質[38]。隨后有研究者利用由內(nèi)生鏈霉菌上清液制備的納米銀處理家蠅后，家蠅出現(xiàn)急性中毒，且家蠅對低濃度納米銀的敏感度略低于淡色庫蚊，但納米銀對家蠅幼蟲的毒殺活性要高于普通殺蟲劑的殺幼蟲活性[39]。

除蚊、蠅外，在蜱螨防治上也開展了一定的研究。 研究人員在微小牛蜱Rhipicephalus(Boophilus)microplus幼蟲包裹試驗中發(fā)現(xiàn)，與單獨使用溴氰菊酯(LC50值為 49.71 mg/L)相比，將溴氰菊酯與由印楝葉制備的納米銀聯(lián)合使用(LC50值為3.87 mg/L)，在較低濃度下就能產(chǎn)生較高的殺螨效果，且聯(lián)合使用時可降低蜱蟲的產(chǎn)卵量和孵化率[40]。另有試驗發(fā)現(xiàn)，相同濃度下納米銀對番茄刺皮癭螨Aculops lycopersici和二斑葉螨Tetranychus urticae的殺滅效果顯著，卵孵化率明顯降低，而對其捕食性天敵植綏螨影響不大[41]。

3.1.2 農(nóng)業(yè)害蟲 截至目前，采用生物源合成的納米銀防治害蟲的研究大多集中于公共衛(wèi)生害蟲，在農(nóng)業(yè)害蟲方面的研究相對較少。2018 年，Suresh 等[42]發(fā)現(xiàn)，以海濱堿蓬葉提取液制備的納米銀對斜紋夜蛾Spodoptera litura的幼蟲和蛹存在較高毒性， LC50達到20～46 mg/L；利用獅耳花提取液合成的納米銀對斜紋夜蛾和棉鈴蟲幼蟲都有高致死性，經(jīng)150 mg/L 的納米銀處理96 h 后，幼蟲最大死亡率分別為78.49%和72.70%[43]。Kamil等[44]的研究表明，納米銀對菜縊管蚜Lipaphis erysimiKalt. 也具有較高毒性，以25 株球孢白僵菌為原料制備的納米銀處理菜蚜96 h 后，菜蚜死亡率最高達60.88%。隨后，在對棉蚜的試驗也發(fā)現(xiàn)，利用美洲大蠊翅提取物合成的納米銀處理后，棉蚜的平均死亡率約為40%[45]。此外，Vadlapudi 等[46]研究了生物源合成的納米銀對赤擬谷盜Tribolium castaneum、谷蠹Rhyzopertha dominica、米象Sitophilus oryzae這3 種儲糧害蟲的毒殺活性。結果發(fā)現(xiàn)，納米銀對3 種儲糧害蟲都只有中度的抑制活性。與之前報道的對蚊蟲的高毒活性相比，納米銀對3 種儲糧害蟲的抑制性較低，這可能與它們具有較厚的角質層，導致低劑量的納米粒子較難穿透其表皮發(fā)生作用有關。

3.2 納米銀的殺蟲機理

為探究生物源合成的納米銀在害蟲防治方面的潛力，預測納米銀作為殺蟲劑在實際應用中所產(chǎn)生的毒理學后果，推動新型納米殺蟲劑的實質性進展，闡明納米銀對害蟲的作用機理至關重要。目前的研究認為DNA 損傷、蛋白質失衡、酶失活及物理損傷等都可能是納米銀對害蟲潛在的作用機制，如圖5 所示。

納米銀對害蟲的毒性受到其粒徑、形狀、聚集程度及其所帶電荷的影響[47]。粒徑小的納米銀可與細胞膜上蛋白質中的磷和核酸中的硫結合，使得細胞膜透性降低，從而造成細胞器功能喪失和酶失活，最終導致害蟲死亡[30]。也有研究者認為，自由基的大量積累和DNA 損傷，引起活性氧(ROS)介導的細胞凋亡可能是納米銀對害蟲的作用機制之一[48]。Nair 等[49]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)納米銀處理后的搖蚊，其核糖體蛋白基因(CrL15)下調，導致蛋白質合成降低，從而引發(fā)慢性毒性；同時，與氧化應激發(fā)生有關的谷胱甘肽S-轉移酶(GST)基因表達發(fā)生不同程度的改變，推測納米銀可能通過改變相關酶基因的表達，從而引發(fā)氧化應激[50]。另外，F(xiàn)ouad 等[28]發(fā)現(xiàn)，納米銀還能顯著降低乙酰膽堿酯酶和α-和?-羧酸酯酶的活性，而乙酰膽堿酯酶活性降低將造成膽堿能神經(jīng)末梢釋放的乙酰膽堿(ChE)不能被及時水解而大量積聚，導致神經(jīng)高度興奮，引發(fā)神經(jīng)中毒，而酯酶是通過裂解羧酸酯和磷酸二酯鍵而參與化學殺蟲劑抗性機制發(fā)展的主要酶，表征高抗性，所以α-和?-羧酸酯酶的活性降低，表明昆蟲抗性下降，導致昆蟲的敏感性下降。

除此以外，研究者還發(fā)現(xiàn)納米銀造成的物理損傷也可能是潛在的作用機制。Fouad 等[51]用兩種芽孢桿菌上清液胞外合成的納米銀對淡色庫蚊Culex pipiens pallens進行了處理。結果發(fā)現(xiàn)，4 齡幼蟲形態(tài)改變，胸腹部變化明顯，肛乳頭區(qū)和角質層損傷嚴重，蛹的頭胸腹也發(fā)生了明顯的畸變。Ga’al 等[52]則發(fā)現(xiàn)，利用沉香精油合成的納米銀對埃及伊蚊Aedes aegypti的中腸上皮細胞和刷狀緣上微絨毛的影響較大，表現(xiàn)為中腸上皮細胞破裂，細胞核退化，上皮細胞嚴重受損，刷狀緣損傷，出現(xiàn)空泡等。Banumathi 等[53]觀察的形態(tài)變化與Ga’al 等發(fā)現(xiàn)的一致，并且還發(fā)現(xiàn)經(jīng)納米銀處理后，埃及伊蚊3 齡幼蟲出現(xiàn)軀體萎縮和外部剛毛缺失；組織病理研究結果顯示，幼蟲中腸和盲腸完全破裂，從而導致蟲體崩塌裂解。

目前已知的生物源合成的納米銀防治害蟲的作用機理大多來源于蚊媒，而納米銀對其他媒介害蟲和農(nóng)業(yè)害蟲如何發(fā)揮毒性作用鮮少涉足。并且，納米銀粒徑、形狀和電荷對各種作用機制的具體影響也有待闡明。鑒于大多研究開展的是短期的急性毒性測定，這將不利于對納米銀毒性作用機理的深入探索。后續(xù)應開展納米銀的長期毒性試驗，更有利于發(fā)現(xiàn)其對害蟲的慢性毒性影響，從而開展廣泛的納米銀毒性機制探討。

4 生態(tài)毒理

納米技術的迅速發(fā)展，使得納米材料在生物醫(yī)學和工業(yè)生產(chǎn)等領域應用十分廣泛。因此，基于納米材料潛在風險的研究就顯得十分必要。為了研究納米粒子的毒性，有研究者以幾種常見田間植物和小鼠為模型，對比研究了化學方法和綠色合成法制備的納米銀，對6 種植物(黑麥草、小麥、蠶豆、野豌豆、萵苣和油菜)的種子萌發(fā)和幼苗生長的影響以及對小鼠間充質干細胞的毒性作用。結果發(fā)現(xiàn)，綠色方法合成的納米銀對植物的毒性和小鼠的細胞毒性明顯低于化學合成的納米銀[54]，進一步佐證了生物源合成的納米銀具有綠色低毒的特性。Ahamed 等[55]也發(fā)現(xiàn)，利用大蒜瓣合成的納米銀對人肺上皮A549 細胞活力、細胞膜完整性和細胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生無影響。然而，有研究顯示，小麥根尖細胞很容易內(nèi)化納米銀，從而影響細胞的正常功能[56]。另外，考慮到魚類會生物累積水環(huán)境中的微量污染物，那么納米銀的潛在釋放也可能通過食用魚類影響人類健康，并且影響生態(tài)環(huán)境。但是目前對于納米銀使用后與生態(tài)系統(tǒng)的相互作用關系還不清楚[57]。因此，開展生物源合成的納米銀的生態(tài)毒理研究以及拓展使用后的動態(tài)監(jiān)測，將對評估納米銀相關的環(huán)境風險等起到至關重要的作用。

5 展望

目前納米材料的應用已經(jīng)涉及醫(yī)學、農(nóng)業(yè)、催化以及生物傳感等諸多領域，亟待大規(guī)模的生產(chǎn)以滿足未來龐大的市場需求。與傳統(tǒng)化學、物理法合成納米材料相比，綠色合成法具有更好的可持續(xù)性和環(huán)境安全性[58]，其低能耗、耗時短、低成本和高效益也顯示出了大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的巨大潛力。

納米材料的綠色合成因其底物低廉、合成流程簡單、無需昂貴設備等特點，以及在抑菌和抗蟲等方面表現(xiàn)出的優(yōu)良性能為重要害蟲的防控提供了新的思路。但是，我們對該領域的研究仍然不夠透徹，很多重要問題仍亟待解決。1) 納米銀的研究大多集中于蚊蠅等媒介害蟲，對其他害蟲的探索和研究不足；2) 綠色合成法涉及到生物資源種類、硝酸銀濃度、反應溫度、酸堿度和時間等變量，制備得到的納米銀的形狀、粒徑和聚集度等理化性質存在一定差異，不同的合成流程對納米銀的理化性質也有很大影響，而理化性質又直接影響其毒性[59-64]，從而限制對納米銀抗蟲的穩(wěn)定性和統(tǒng)一性的判斷；3) 當前納米銀抗蟲作用機制以及對有益生物的研究數(shù)據(jù)不足，影響后續(xù)的安全性評估，使得納米銀暴露在自然環(huán)境中對包括人類在內(nèi)的非靶標生物以及環(huán)境產(chǎn)生的毒性不易預測。因此，為了促進新型納米殺蟲劑的應用，優(yōu)化綠色合成流程，統(tǒng)一合成納米粒子的尺寸，提高其對害蟲的毒性作用，同時降低對非靶標生物的影響以及對環(huán)境的威脅，將會成為未來納米農(nóng)藥領域重要的研究方向。