田芳，王鵬，孫萍，魏玉翠，李浩，仇方忻

慢性腎功能衰竭(chronic renal failure，CRF)是多種慢性腎臟疾病的常見結(jié)局，已成為我國重要的公共衛(wèi)生問題[1]。CRF的特征是腎小球?yàn)V過率降低和腎功能障礙，導(dǎo)致代謝紊亂和相關(guān)臨床癥狀[2]。然而，目前還沒有任何有效的治療方法來延緩或治療慢性腎功能衰竭。因此，研發(fā)成功的治療策略具有重要的臨床意義[3]。中醫(yī)藥在治療慢性腎功能衰竭方面越來越受臨床的重視[4-5]。四逆湯源自張仲景的《傷寒論》[6]。葉文沖等[7]研究發(fā)現(xiàn)，四逆湯可改善膜性腎病大鼠的腎小球和毛細(xì)血管結(jié)構(gòu)，發(fā)揮明顯治療作用。p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK)/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2(extracellular signal-regulated kinase，ERK1/2)通路直接參與腎臟的形成，調(diào)節(jié)腎源性間充質(zhì)的維持和分化[8]。目前，關(guān)于四逆湯治療CRF的文獻(xiàn)罕見報(bào)道，因此現(xiàn)構(gòu)建CRF大鼠模型，探究四逆湯對(duì)CRF大鼠的干預(yù)作用，并分析其對(duì)p38 MAPK/ERK1/2通路的影響，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)動(dòng)物：雄性SPF級(jí)SD大鼠，10周齡，體質(zhì)量200～220 g，購自山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(魯)2019-0021，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(魯)2019-0029，大鼠自由飲水進(jìn)食，本實(shí)驗(yàn)經(jīng)山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬青島醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)：倫審字2020103號(hào))，并遵守3R保護(hù)原則進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。(2)藥物試劑：四逆湯(西安利君制藥有限責(zé)任公司)；氯沙坦鉀片(杭州默沙東制藥有限公司)；尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)、尿酸(UA)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；白介素-6(IL-6)、IL-1β、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒、蘇木素—伊紅(HE)染色試劑盒、TUNEL檢測試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司)；p38 MAPK一抗、磷酸化p38 MAPK(p-p38 MAPK)一抗、ERK1/2一抗、磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)一抗、β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)一抗及兔抗鼠二抗(美國Cell Signaling Technology公司)。(3)儀器設(shè)備：RM2035型輪轉(zhuǎn)切片機(jī)(德國Leica公司)，SMZ745型光學(xué)顯微鏡(日本尼康公司)，Elx800型酶標(biāo)儀、1658033型蛋白垂直電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)，GelSMART型凝膠成像儀(北京大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 2020年10月—2021年1月于山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬青島醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，按照文獻(xiàn)[9]方法，對(duì)大鼠飼喂含0.75%腺嘌呤的飼料，連續(xù)飼養(yǎng)4周后，檢測到血清BUN和SCr水平明顯升高，表明CRF大鼠模型建立成功，成功造模60只大鼠。將CRF大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成模型組、氯沙坦組(給予氯沙坦鉀片9 mg/kg，與蒸餾水配成濃度0.9 mg/ml的混懸液灌胃)[10]及四逆湯低、中、高劑量組(2.79、5.58、11.16 g/kg灌胃)[11]，每組12只；另取健康大鼠12只設(shè)為對(duì)照組，所喂養(yǎng)飼料除未添加腺嘌呤外，所有成分均相同。對(duì)照組和模型組大鼠灌胃等體積蒸餾水；6組大鼠灌胃液體體積均為10 ml/kg，每日1次，連續(xù)4周。

1.3 觀察指標(biāo)與方法

1.3.1 樣本采集及腎臟指數(shù)測定：大鼠末次給藥24 h后予以麻醉，主動(dòng)脈取血，離心分離血清，-80℃下保存待測；采血后稱大鼠體質(zhì)量，解剖腎臟并稱質(zhì)量，計(jì)算腎臟指數(shù)=腎臟質(zhì)量/大鼠體質(zhì)量。左腎固定于4%甲醛溶液中，進(jìn)行組織病理學(xué)檢測；右腎液氮速凍，-80℃下保存，用于檢測蛋白表達(dá)情況。

1.3.2 血清BUN、SCr、UA檢測：取上述血清，根據(jù)試劑盒說明書檢測大鼠血清BUN、SCr、UA水平。

1.3.3 血清炎性因子檢測：取上述血清，根據(jù)ELISA試劑盒說明書檢測大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平。

1.3.4 腎組織病理學(xué)觀察：取出固定在甲醛中左腎組織，脫水透明，石蠟包埋，切片厚度3 μm，HE染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察病理學(xué)變化。

1.3.5 腎組織細(xì)胞凋亡檢測：取石蠟切片，脫蠟，蛋白酶消化20 min后清洗，加入TUNEL反應(yīng)混合液，于37℃下封閉30 min，加底物顯色，蘇木素復(fù)染、脫水、封片。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別隨機(jī)選取5張切片，每張切片選擇5個(gè)具有代表性的高倍視野(×400)，計(jì)算TUNEL染色的陽性細(xì)胞數(shù)，凋亡指數(shù)=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.3.6 腎臟組織蛋白表達(dá)測定：取出-80℃中保存的腎組織，液氮研磨，加入裂解液勻漿化，提取總蛋白，BCA法檢測蛋白含量，電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜封閉加一抗(p38 MAPK、p-p38 MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2、β-actin，稀釋倍數(shù)1∶1 000)，4℃條件下孵育過夜，洗膜孵二抗，室溫孵育2 h，洗膜顯色曝光，使用凝膠成像系統(tǒng)觀察，以β-actin為內(nèi)參蛋白分析蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠腎臟指數(shù)比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠腎臟指數(shù)顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，氯沙坦組和四逆湯各劑量組大鼠腎臟指數(shù)顯著降低(P<0.05)；四逆湯低、中、高劑量組大鼠腎臟指數(shù)依次降低(P<0.05)；與氯沙坦組比較，四逆湯低劑量組大鼠腎臟指數(shù)顯著升高(P<0.05)，四逆湯中劑量組大鼠腎臟指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，四逆湯高劑量組大鼠腎臟指數(shù)顯著降低(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠腎臟指數(shù)比較

2.2 各組大鼠血清BUN、SCr、UA水平比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清BUN、SCr、UA水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，氯沙坦組和四逆湯各劑量組上述指標(biāo)顯著降低(P<0.05)；四逆湯低、中、高劑量組上述指標(biāo)依次降低(P<0.05)；與氯沙坦組比較，四逆湯低劑量組上述指標(biāo)顯著升高(P<0.05)，四逆湯中劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，四逆湯高劑量組顯著降低(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠血清BUN、SCr、UA水平比較

2.3 各組大鼠血清炎性因子比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，氯沙坦組和四逆湯各劑量組大鼠上述指標(biāo)顯著降低(P<0.05)；四逆湯低、中、高劑量組上述指標(biāo)水平依次降低(P<0.05)；與氯沙坦組比較，四逆湯低、中劑量組上述指標(biāo)顯著升高(P<0.05)，四逆湯高劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 各組大鼠血清炎性因子水平比較

2.4 各組大鼠腎組織病理變化比較 對(duì)照組大鼠腎組織無明顯病變；與對(duì)照組比較，模型組腎小球結(jié)構(gòu)紊亂，腎小球基底膜增厚，腎小球硬化纖維化，腎小管明顯擴(kuò)張纖維化，間質(zhì)水腫，大量炎性細(xì)胞浸潤；氯沙坦組和四逆湯各劑量組腎損害和炎性反應(yīng)明顯減輕。與氯沙坦組比較，四逆湯低、中劑量組差異較為明顯，而四逆湯高劑量組無明顯差別，見圖1。

2.5 各組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，氯沙坦組和四逆湯各劑量組細(xì)胞凋亡指數(shù)均顯著降低(P<0.05)；四逆湯低、中、高劑量組細(xì)胞凋亡指數(shù)依次降低(P<0.05)；與氯沙坦組比較，四逆湯低劑量組細(xì)胞凋亡指數(shù)顯著升高(P<0.05)，四逆湯中劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，四逆湯高劑量組顯著降低(P<0.05)，見表4。

表4 各組大鼠腎組織細(xì)胞凋亡指數(shù)比較

2.6 各組大鼠腎組織p38 MAPK、p-p38 MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠腎組織p-p38 MAPK/p38 MAPK、(p-ERK1/2)/(ERK1/2)蛋白水平均顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，氯沙坦組和四逆湯各劑量組上述指標(biāo)均顯著降低(P<0.05)；四逆湯低、中、高劑量組上述指標(biāo)依次降低(P<0.05)；與氯沙坦組比較，四逆湯低劑量組上述指標(biāo)顯著升高(P<0.05)，四逆湯中劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，四逆湯高劑量組顯著降低(P<0.05)，見圖2、表5。

表5 各組大鼠腎組織p-p38 MAPK/p38 MAPK、(p-ERK1/2)/(ERK1/2)蛋白比較

注：黃色箭頭表示腎小球

注：A.對(duì)照組；B.模型組；C.氯沙坦組；D.四逆湯低劑量組；E.四逆湯中劑量組；F.四逆湯高劑量組

3 討 論

CRF病理進(jìn)程伴隨不可逆的腎單位逐漸丟失最終導(dǎo)致腎小球硬化、腎小管萎縮和腎臟單位數(shù)目進(jìn)一步減少[12]，可產(chǎn)生一系列復(fù)雜的不良反應(yīng)，最終導(dǎo)致進(jìn)行性腎損傷和功能嚴(yán)重下降。高水平BUN和SCr是慢性腎功能衰竭腎功能異常的標(biāo)志[13]。Li等[14]報(bào)道腺嘌呤誘導(dǎo)的CRF大鼠模型，可產(chǎn)生類似人類慢性腎病的代謝異常，包括氮質(zhì)血癥、尿毒癥毒素堆積、氨基酸和電解質(zhì)的代謝失衡及激素失衡。UA為嘌呤代謝的產(chǎn)物，可通過電壓敏感的尿酸鹽通道和尿酸鹽—陰離子交換機(jī)制在近端小管中重新吸收和排泄[15]。在腎臟疾病患者中，UA排泄減少，易造成體內(nèi)UA增多。本研究采用腺嘌呤喂養(yǎng)大鼠，鏡下可見大鼠腎小球結(jié)構(gòu)紊亂、基底膜增厚、硬化纖維化，腎小管明顯擴(kuò)張纖維化，間質(zhì)水腫，大量炎性細(xì)胞浸潤，大鼠腎臟指數(shù)、腎組織細(xì)胞凋亡指數(shù)，且伴隨血清中BUN、SCr、UA水平顯著升高，表明CRF大鼠模型構(gòu)建成功。CRF不僅是一系列復(fù)雜的生化反應(yīng)，而且是一種全身性慢性炎性反應(yīng)。已有研究表明，在腎炎動(dòng)物模型和患者中，促炎細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α有助于腎炎的進(jìn)展[16]。本研究亦觀察到，模型組大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α水平顯著升高，表明CRF大鼠體內(nèi)炎性反應(yīng)明顯，與上述研究結(jié)果一致，提示促炎細(xì)胞因子在腎臟炎性疾病和腎小球硬化的發(fā)展中起重要作用。

四逆湯是《傷寒論》的經(jīng)典方，主要治療血虛寒厥證，制附子為君，可回陽救逆、逐風(fēng)寒濕邪；干姜為臣，可溫中散寒、助附回陽；炙甘草為佐，補(bǔ)脾益氣、調(diào)和諸藥，三藥組分配伍，具有補(bǔ)腎益氣之功效[7]。研究發(fā)現(xiàn)，組分配伍四逆湯對(duì)被動(dòng)型Heymann腎炎大鼠有明顯的改善作用，可顯著降低大鼠血清中BUN、SCr、UA水平，減輕腎組織病理變化[17]。本研究觀察到，CRF大鼠在四逆湯干預(yù)作用下，腎組織病理變化明顯減輕，腎臟指數(shù)、腎組織細(xì)胞凋亡指數(shù)、血清中BUN、SCr、UA、炎性因子水平均顯著降低，表明四逆湯可改善CRF大鼠的病理狀況，減輕炎性反應(yīng)。

p38 MAPK/ERK1/2途徑可被各種刺激激活，并有助于調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、存活、凋亡等作用[18]。Tao等[19]研究發(fā)現(xiàn)，抑制ERK1/2表達(dá)可減輕高尿酸血癥腎病大鼠腎小管細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和凋亡。甜菜堿可通過p38 MAPK/ERK1/2信號(hào)通路影響腎小球系膜細(xì)胞的增殖與凋亡[20]。本研究中，模型組大鼠腎組織p-p38 MAPK/p38 MAPK、(p-ERK1/2)/(ERK1/2)蛋白水平顯著升高，說明CRF大鼠體內(nèi)p38 MAPK、ERK1/2蛋白活化增強(qiáng)，刺激細(xì)胞凋亡。有研究發(fā)現(xiàn)，桂枝附子湯可抑制膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠p38 MAPK信號(hào)通路的活化，緩解炎性反應(yīng)[21]。在支氣管哮喘小鼠模型中，甘草酸可抑制p38 MAPK和ERK1/2蛋白磷酸化，減輕炎性反應(yīng)[22]。本研究結(jié)果顯示，四逆湯各劑量組大鼠腎組織p-p38 MAPK/p38 MAPK、(p-ERK1/2)/(ERK1/2)蛋白水平均顯著降低，表明四逆湯可抑制p38 MAPK、ERK1/2蛋白活化，減輕腎組織炎性反應(yīng)，進(jìn)而改善CRF大鼠的腎組織損傷。

綜上所述，四逆湯可抑制CRF大鼠腎組織中p38 MAPK/ERK1/2信號(hào)通路的活化，降低UA水平，改善腎組織損傷，提高腎功能。然而，CRF的發(fā)病機(jī)制比較復(fù)雜，四逆湯的藥效作用仍有待于進(jìn)一步研究。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

田芳：設(shè)計(jì)研究方案，課題設(shè)計(jì)，實(shí)施研究過程，論文撰寫；仇方忻、王鵬：提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核；魏玉翠：實(shí)施研究過程，資料搜集整理，論文修改；孫萍、李浩：進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析