劉慧玲，譚定英，黃 敏，陳平平，張 望

1 廣州中醫(yī)藥大學醫(yī)學信息工程學院，廣東廣州 510006；

2 廣州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，廣東廣州540120

糖尿病是一種以高血糖為主要特征的代謝性疾病，據(jù)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示：我國20 歲以上的人群患病率為9.7%［1］。糖尿病及其并發(fā)癥對人體有極大的傷害，目前關(guān)于糖尿病并發(fā)癥的研究主要集中在糖尿病心血管病變、糖尿病視網(wǎng)膜病變、糖尿病自主神經(jīng)病變和糖尿病腎?。?］。中醫(yī)學認為，2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）及其并發(fā)癥的病因病機為濕熱內(nèi)盛、陰虛燥熱、痰瘀阻絡(luò)［3］，治療以清熱燥濕、養(yǎng)陰清熱、化痰通絡(luò)為主。中藥具有“多成分-多靶點-多通路”的特點，目前廣泛應(yīng)用于糖尿病的治療，且臨床療效顯著［4］。黃連具有清熱燥濕功效，能有效改善2型糖尿病患者臨床癥狀，降低血糖，療效肯定。但是，目前對黃連治療2型糖尿病的具體藥效基礎(chǔ)及作用機制尚未明確［5］。為此，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學及分子對接篩選黃連的活性成分及作用靶點，探討其治療2型糖尿病多成分-多靶點-多通路的藥理學作用機制，以期為黃連治療2型糖尿病提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 黃連活性成分篩選與靶點預(yù)測

以“黃連”為關(guān)鍵詞，利用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（traditional Chinese medicine systems phar?macology database and analysis platform，TCMSP）、UniProt 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，設(shè)置口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，藥物相似性（drug-likeness，DL）≥0.18 作為篩選條件［6-7］，獲取黃連的活性成分，并從TCMSP數(shù)據(jù)庫中篩選出對應(yīng)的靶點。

1.2 2型糖尿病相關(guān)基因及黃連潛在作用靶點預(yù)測

以“type 2 diabetes mellitus”為關(guān)鍵詞，在毒性與基因比較數(shù)據(jù)庫（comparative toxicogenomics database，CTD）檢索疾病相關(guān)基因，去掉重復(fù)靶點，并使用韋恩圖獲取黃連活性成分及2型糖尿病疾病的共同靶點，即為黃連作用于2型糖尿病的潛在作用靶點。

1.3 黃連-活性成分-潛在作用靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

采用Cytoscape 3.6.1 軟件將黃連活性成分與潛在作用靶點導(dǎo)入，構(gòu)建“黃連-活性成分-潛在作用靶點”網(wǎng)絡(luò)，并使用Network Analyzer 插件進行網(wǎng)絡(luò)拓撲分析，得出黃連作用于2 型糖尿病的主要潛在靶點。

1.4 構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

將共同靶點導(dǎo)入STRING 分析平臺，構(gòu)建黃連治療2 型糖尿病的蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)。設(shè)定研究物種為“Homo sapiens”，蛋白相互作用閾值（medium confidence）＞0.900［8］，選擇K-means聚類分析，并將分析結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape3.6.1軟件中進行拓撲分析，得出黃連作用于2 型糖尿病的核心靶點。

1.5 生物信息學分析

采用DAVID 和Hiplot 科研數(shù)據(jù)可視化平臺對黃連治療2 型糖尿病的20 個核心靶點進行基因本體（gene ontology，GO）功能富集分析、京都基因和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and ge?nomes，KEGG）信號通路分析，設(shè)定P＜0.01，并分析治療2型糖尿病的主要通路。

1.6 分子對接

選擇PPI 拓撲分析篩選所得的核心靶基因及其對應(yīng)的活性成分進行半柔性分子對接，利用Pub?Chem 數(shù)據(jù)庫得到黃連活性成分的2D 結(jié)構(gòu)信息，用ChemBio3D Ultra 14.0.0.117 軟件轉(zhuǎn)換為3D 結(jié)構(gòu)并優(yōu)化最小自由能，使用PDB 數(shù)據(jù)庫查找靶蛋白，利用AutoDockTools 1.5.6 軟件分別對小分子（活性成分）和對接受體（靶蛋白）進行預(yù)處理，包括刪去靶蛋白晶體結(jié)構(gòu)中的配體分子和水分子，加氫、加電荷、賦予原子類型。結(jié)合位點定義及格點參數(shù)計算，設(shè)置構(gòu)象搜索方法與對接參數(shù)并輸出dpf 格式文件，進行分子對接計算，獲得黃連的活性分子與靶蛋白的對接結(jié)果，將50個構(gòu)象按能量排序查看結(jié)果，存儲最優(yōu)構(gòu)象即結(jié)合能最小的構(gòu)象。利用Py?MOL 2.4.1打開查看對接圖像，繪制靶蛋白與小分子相互作用圖，觀察其結(jié)合模式以及與周邊氨基酸殘基的相互作用?；钚猿煞峙c靶蛋白之間相互作用強度大小可用對接分數(shù)表示，該數(shù)值為負數(shù)提示該活性成分能與靶標自由結(jié)合，數(shù)值越小表示結(jié)合度越好。一般認為當結(jié)合親和力（binding affinity）＜-7.0 kcal/mol（1 kca/mol＝4.186 kJ/mol）時說明活性分子與靶蛋白有強烈的結(jié)合活性［9］。

1.7 引用和參考的數(shù)據(jù)庫

見表1。

表1 參考數(shù)據(jù)庫Table 1 Collections of database

2 結(jié)果

2.1 黃連活性成分及其靶點預(yù)測結(jié)果

根據(jù)篩選條件OB≥30%、DL≥0.18 從TCMSP 數(shù)據(jù)庫篩選出黃連活性成分14 種，見表2。通過TC?MSP 中的Related Targets 進行篩選、刪除重復(fù)項，獲得黃連對應(yīng)的有效靶點189 個，并利用UniProt 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進行匹配，得到對應(yīng)的靶點基因。

表2 黃連活性成分Table 2 Active ingredients of Coptis chinensis

2.2 獲取黃連的潛在作用靶點

以“type 2 diabetes mellitus”為關(guān)鍵詞，在CTD數(shù)據(jù)庫進行基因檢索，檢索到與T2DM 相關(guān)的疾病基因有9 813 個，利用韋恩分析，得出黃連治療T2DM的潛在作用靶點136個。篩選出小檗堿、槲皮素、氫化小檗堿等主要活性成分對應(yīng)的靶點見表3。

表3 黃連主要活性成分及其對應(yīng)靶點Table 3 Main active ingredients and corresponding targets of Coptis chinensis

2.3 黃連-活性成分-潛在作用靶點網(wǎng)絡(luò)

黃連-活性成分-潛在作用靶點網(wǎng)絡(luò)見圖1。其中，綠色節(jié)點即為黃連，黃色節(jié)點為黃連的各活性成分，其余藍色節(jié)點為活性成分對應(yīng)的潛在作用靶點，體現(xiàn)中藥“多成分-多靶點”的特點。該網(wǎng)絡(luò)由151 個節(jié)點，146 條邊構(gòu)成，平均度值（degree）為2.04。以各節(jié)點的度值（degree）大小進行排序，在網(wǎng)絡(luò)中活性成分的度值較高則可能為核心節(jié)點。如槲皮素（degree＝102）、氫化小檗堿（degree＝16）、小檗堿（degree＝13）、小檗浸堿（degree＝4）、巴馬?。╠egree＝4），這些可能是黃連發(fā)揮藥效的主要活性成分。而靶點度值較高NOS2（degree＝2），PTGS2（de?gree＝2）、RXRA（degree＝2）、ADRA1D（degree＝2），則可能為黃連治療2 型糖尿病的主要潛在作用靶點。

圖1 黃連-活性成分-潛在作用靶點網(wǎng)絡(luò)Figure 1 Coptis chinensis-active ingredient-potential target network

2.4 黃連治療2型糖尿病的潛在作用靶點PPI網(wǎng)絡(luò)分析

將黃連的潛在作用靶點導(dǎo)入STRING 平臺構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，設(shè)置高置信度（high confidence<0.900>），隱藏無連接的靶點，見圖2。

圖2 蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)Figure 2 Protein interaction(PPI)network

STRING 根據(jù)與其相互作用的score值對顏色進行映射。不同顏色的邊代表不同相互作用類型，紫色的邊表示2 個節(jié)點之間的聯(lián)系已通過實驗驗證（experimentally determined），綠色代表基因相鄰（gene neighborhood），紅色代表基因融合（gene fusions），深藍色代表著基因共現(xiàn)（gene co-occurrence），淡藍色則表示二者蛋白質(zhì)同源（protein homology）。將所得PPI數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件進行可視化分析，該PPI網(wǎng)絡(luò)包含有136個節(jié)點，415 條邊，經(jīng)Network An?alyzer 拓撲分析后，以各靶點的度值（degree）大小進行排序，前20 名的基因見表4。由此預(yù)測前20個靶點可能是黃連治療2型糖尿病的核心靶點。

表4 作用靶點的拓撲學分析結(jié)果（度值排名前20）Table 4 Topological analysis results of action targets（top 20 in degree value ranking）

2.5 黃連治療2型糖尿病的GO富集分析

對黃連作用于2 型糖尿病的20 個核心靶點進行基因本體論（gene ontology，GO）功能富集分析。富集分析后共獲得2 485 個條目，其中，生物過程（biological process，BP）有2 243個、分子功能（molec?ular function，MF）有152 個、細胞組成（cellular com?ponents，CC）共有90 個，見圖3。在BP 方面主要涉及腺發(fā)育、上皮細胞增殖、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的調(diào)節(jié)、氧化應(yīng)激及對脂多糖等多種細胞凋亡反應(yīng)。在MF 方面主要涉及DNA 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、酶結(jié)合、受體結(jié)合等。在CC 方面主要涉及酶調(diào)節(jié)復(fù)合物、囊腔、膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)的構(gòu)成。由此表明，黃連可調(diào)控多種生物反應(yīng)參與治療2型糖尿病。

圖3 GO富集分析結(jié)果Figure 3 GO enrichment analysis results

2.6 黃連治療2型糖尿病的KEGG通路富集分析

采用DAVID、Hiplot 數(shù)據(jù)庫對20 個核心靶點進行京都基因和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析，設(shè)定生物信息通路P＜0.01，KEGG 通路富集共得到187 條通路，其中具有顯著意義的有137條，按通路中含有的基因數(shù)量進行排序，前20 條顯著通路信息見表5。黃連參與調(diào)控2型糖尿病主要有MAPK、糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）-RAGE、PI3K-Akt、Toll 樣受體、HIF-1 及TNF 信號通路，參與調(diào)控的基因靶點主要有絲裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1（AKT1）、腫瘤抗原p53（TP53）、轉(zhuǎn)錄因子AP-1（JUN）、腫瘤壞死因子（TNF）、白細胞介素-6（IL-6）等。一條通路含有多個靶點，一個靶點也參與了多條通路，這表明黃連治療2 型糖尿病可能與其“多靶點-多通路”的作用機制有關(guān)。

表5 黃連治療2型糖尿病的KEGG通路信息Table 5 KEGG pathway information of Coptis chinensis in the treatment of type 2 diabetes

2.7 分子對接及結(jié)合自由能分析

本研究選取黃連作用于2 型糖尿病的20 個核心靶點與黃連的2 個有效成分進行分子對接，以驗證黃連活性成分與靶點的對應(yīng)關(guān)系，通過結(jié)合自由能判斷分子間的結(jié)合能力。結(jié)果顯示，20 組對接結(jié)果的結(jié)合能均＜-7 kcal/mol。見表6、圖4。

圖4 分子對接三維圖Figure 4 Three dimensional view of molecular docking

表6 分子對接結(jié)果Table 6 Results of molecular docking

3 討論

本研究使用網(wǎng)絡(luò)藥理學的研究方法，以口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18 篩選出小檗堿、槲皮素等14 種活性成分，對應(yīng)189 個有效靶點。通過建立“黃連-活性成分-潛在作用靶點”網(wǎng)絡(luò)，根據(jù)各活性成分的degree值，排序較前的活性成分主要有槲皮素、氫化小檗堿、小檗堿等。槲皮素藥理活性廣泛，具有抗氧化、抗炎、降血糖、降血脂等藥理學作用多種生物活性［10］，可能在預(yù)防和治療糖尿病中發(fā)揮作用。小檗堿具有抗菌、抗病毒、降血糖、降脂、改善胰島素抵抗、調(diào)節(jié)慢性炎癥、抗微生物等藥理學作用［11-12］。分子對接結(jié)果顯示，小檗堿、槲皮素與靶基因具有良好的結(jié)合作用，提示本次所篩選出的黃連主要活性成分，其治療2 型糖尿病具有一定的藥理學基礎(chǔ)。

本研究PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，黃連治療2型糖尿病的作用核心靶點主要有MAPK1、AKT1、TP53、JUN、TNF、IL-6。分子對接結(jié)果顯示，黃連的主要活性成分和靶點之間的結(jié)合構(gòu)型具有強烈的活性，如槲皮素與EGF、IL-1β、TNF、MAPK1、IL-6 等蛋白形成較好的對接模式與較高親和力。這提示這些核心靶點均可能是黃連治療T2DM 的潛在作用靶點。KEGG 通路富集分析顯示，參與調(diào)控主要通路有MAPK、AGEs-RAGE、PI3K-Akt、Toll樣受體、HIF-1、TNF等信號通路。每個基因靶點作用于多條信號通路，推測黃連是通過調(diào)控以上靶點來發(fā)揮治療2 型糖尿病的作用。綜合GO 功能與KEGG 通路富集分析結(jié)果，提示黃連治療2 型糖尿病是一個相對復(fù)雜的作用機制。這可能與以下因素有關(guān)。

3.1 調(diào)控糖脂代謝

在KEGG 通路富集分析中，MAPK 信號通路的顯著性最高，富集了14 個基因靶點數(shù)。MAPK 為生物能量代謝調(diào)節(jié)的關(guān)鍵分子，可調(diào)節(jié)機體糖、脂代謝。在高糖狀態(tài)下，由多種因素激活MAPK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與機體糖脂代謝的調(diào)控［13］。有氧運動可以抑制或減輕機體胰島素抵抗發(fā)生，而MAPK 可能是有氧運動抑制或改善胰島素抵抗的另一重要因子［14］。小檗堿可以通過改善氧化應(yīng)激，在一定程度上增加胰島素的表達以及β 細胞的再生，激活各種組織如脂肪、肌肉中的MAPK信號通路，從而降低血糖水平［15］。PI3K-Akt 信號通路是胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要途徑，在糖脂代謝中扮演重要角色，其可通過介導(dǎo)生長因子，從而對葡萄糖穩(wěn)態(tài)和脂質(zhì)代謝起調(diào)控作用［16］。這提示，黃連治療2 型糖尿病可能與調(diào)控糖脂代謝有關(guān)。

3.2 調(diào)控炎癥反應(yīng)

2 型糖尿病是自然免疫和先天性疾病，是一種慢性低度炎癥狀態(tài)，炎癥是誘發(fā)2 型糖尿病的重要因素之一。本研究富集分析結(jié)果顯示，黃連可通過調(diào)控多個生長因子（EGFR、VEGFA、TNF 等）及炎癥因子（IL-6、IL-1β），參與調(diào)控MAPK、Toll 樣受體、TNF 等信號通路。TNF-α 是一類能造成腫瘤細胞死亡的細胞因子，具有廣泛的生物學效應(yīng)，其能夠介導(dǎo)MAPK 信號通路，促進IL-1、IL-6、CRP 等多種促炎介質(zhì)的產(chǎn)生，從而啟動炎癥級聯(lián)反應(yīng)［17］。Toll樣受體為機體免疫防御系統(tǒng)的重要一環(huán)，其可通過對病原相關(guān)分子模式識別來調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答與炎癥反應(yīng)，對T2DM 患者的炎性反應(yīng)、胰島素抵抗有明顯的調(diào)控效果［18］。本研究認為黃連的作用靶點主要為MAPK1、AKT1、TP53、JUN、TNF、IL-6，其有效成分小檗堿可能通過參與MAPK、Toll 樣受體等信號通路的調(diào)控而抑制慢性炎癥，進而緩解異常代謝和胰島素抵抗，這與操映倩等［19］研究結(jié)果一致，但其認為小檗堿是與Hsp90b1、Pdia6、Prdx5、Pdia4、Itgam、PTGS1、NOS2、IL-10 等靶點相互作用，從而調(diào)控炎癥反應(yīng)的觀點與本研究結(jié)果存在一定差異。

3.3 調(diào)控細胞增殖與凋亡

AGEs-RAGE 通路可調(diào)控胰島細胞凋亡、功能受損的過程。本研究KEGG 通路富集分析顯示，AGEs-RAGE 信號通路富集了MAPK1、AKT1、JUN、TNF、IL-6 等11 個基因靶點，是顯著性較高的通路。當AGEs 水平升高時，可通過上調(diào)胰島細胞表面RAGE 受體表達，激活氧化酶而使核因子κB（NFκB）表達增高，從而導(dǎo)致胰島細胞凋亡［20］。PI3KAkt 信號通路也是機體內(nèi)細胞增殖、分化、凋亡的重要信號通路，可對糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展發(fā)揮調(diào)控作用。本研究顯示，小檗堿可通過調(diào)控PI3KAkt 信號通路，抑制細胞增殖，從而影響糖尿病血管病變，與朱昌國等［21］研究結(jié)果相似。

3.4 促進氧化應(yīng)激

氧化應(yīng)激貫穿于糖尿病并發(fā)癥發(fā)病機制的始終。糖尿病患者糖基化終產(chǎn)物（AGEs）升高，與受體結(jié)合后促使活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成，產(chǎn)生氧自由基，細胞膜發(fā)生超氧化，使維持離子狀態(tài)的膜蛋白功能受損，最終導(dǎo)致細胞結(jié)構(gòu)、功能、代謝異常，誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)［22］。HIF-1α 作為調(diào)節(jié)細胞內(nèi)氧代謝的關(guān)鍵因子之一，是目前發(fā)現(xiàn)的唯一能在特異性缺氧狀態(tài)下發(fā)揮活性的轉(zhuǎn)錄因子，對糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生、發(fā)展起促進作用［2］。本研究KEGG 通路富集分析顯示，HIF-1 信號通路在GO 分析中的BP 環(huán)節(jié)準確度較高，富集了TNF、MAPK1 等9 個基因靶點。而黃連有效成分可作用于上述基因靶點，調(diào)控HIF-1信號通路，從而調(diào)節(jié)機體氧化應(yīng)激反應(yīng)，達到治療糖尿病及其并發(fā)癥的目的。

4 結(jié)語

本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學和分子對接角度證實黃連治療2 型糖尿病是一個相對復(fù)雜的過程，其主要活性成分為槲皮素、小檗堿等，可能通過作用于MAPK1、AKT1、TP53、JUN、TNF、IL-6 等相關(guān)靶點，參與調(diào)控MAPK、AGEs-RAGE、PI3K-Akt、Toll 樣受體、HIF-1、TNF 信號通路，通過調(diào)控糖脂代謝及炎癥反應(yīng)、調(diào)控細胞增殖與凋亡、促進氧化應(yīng)激等多方面以發(fā)揮治療2型糖尿病及其并發(fā)癥的作用。但本研究仍存在一些不足之處，如僅預(yù)測定制藥物化學成分作用靶點，沒有對靶點進行上調(diào)和下調(diào)的預(yù)測，未能預(yù)測功能改變的方向。下一步將通過實驗驗證網(wǎng)絡(luò)藥理學篩選出來的黃連主要活性成分與關(guān)鍵靶點的級聯(lián)效應(yīng)，為黃連治療2 型糖尿病提供進一步依據(jù)。