王澤宇，丁妍怡，戴雅玲，楊敏光，黃 佳，張勝行，3*

1 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院，上海 200025；

2 福建中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，福建福州 350122；

3 中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇〇醫(yī)院，福建福州350025

血管性認(rèn)知障礙（vascular cognitive impairment，VCI）是由腦血管病變及其危險(xiǎn)因素導(dǎo)致的腦組織缺血缺氧或組織損傷等誘發(fā)的認(rèn)知障礙綜合征［1］。研究顯示，阿爾茨海默病是癡呆的首要病因，血管性因素是癡呆的次要病因，但2019 年《美國心臟病學(xué)會雜志》研究報(bào)道顯示，在東亞地區(qū)血管性因素是癡呆的主要病因［2］。血管性認(rèn)知障礙在中醫(yī)學(xué)中屬于“癡呆”范疇，其病位在腦?！端貑枴っ}要精微論》言：“頭者，精明之腑?！鳖^為諸陽，腦為元神之府，諸陽經(jīng)皆上頭與腦發(fā)生直接或間接的聯(lián)系，與臟腑經(jīng)絡(luò)關(guān)系密切［3］。因此，針刺頭穴可加強(qiáng)經(jīng)脈之間的聯(lián)系，激發(fā)經(jīng)氣，疏通經(jīng)絡(luò)，調(diào)整全身臟腑氣血。研究證實(shí)，針刺“神庭”“百會”可激活認(rèn)知功能相關(guān)腦區(qū)，包括額葉、顳葉、扣帶回和海馬等腦區(qū)，其中學(xué)習(xí)記憶功能改變與海馬緊密相關(guān)［4-5］。學(xué)習(xí)和記憶、日常生活中的短期記憶都儲存在海馬體中，當(dāng)海馬區(qū)受損時會導(dǎo)致健忘。研究發(fā)現(xiàn)，針刺可以改善海馬神經(jīng)元損傷，在腦缺血中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［6］。針刺百會穴可顯著增強(qiáng)腦缺血大鼠的海馬神經(jīng)元密度，改善其突觸可塑性，進(jìn)而改善認(rèn)知行為。因此，針刺治療VCI 很可能是通過改善海馬功能實(shí)現(xiàn)的［7］。本研究采用小動物磁共振成像探討電針“百會”“神庭”穴干預(yù)VCI大鼠海馬功能活動情況，并利用Agilent mRNA 表達(dá)譜芯片分析電針調(diào)控的關(guān)鍵效應(yīng)分子及其作用途徑，以期為探究電針治療血管性認(rèn)知障礙可能的作用機(jī)制提供可借鑒的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組

選擇雄性SPF 級SD 大鼠24 只，體質(zhì)量（280±30）g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限責(zé)任公司提供［生產(chǎn)許可證號碼：SCXK（滬）2017-0005］，飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心［許可證號：SYXK（閩）2020-0002］。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、電針組，每組8 只。本實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：FJTCM IACUC 2019036）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動物模型制備 采用雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎法制備VCI大鼠模型［8］。模型組、電針組大鼠術(shù)前均禁食24 h，用2%戊巴比妥鈉（0.2 mL/100 g）進(jìn)行腹腔注射麻醉；分離左、右側(cè)頸總動脈，采用不可吸收外科手術(shù)線結(jié)扎頸總動脈；手術(shù)后腹腔注射20 萬U/mL青霉素鈉溶液（0.05 mL/100 g）。假手術(shù)組大鼠僅分離雙側(cè)頸總動脈但不結(jié)扎。所有大鼠術(shù)后放置于26 ℃室溫下等待其自然蘇醒后再放回籠中飼養(yǎng)。

1.2.2干預(yù)方法 電針組大鼠術(shù)后第14 天，參考《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》的方法選取大鼠百會、神庭穴進(jìn)行電針干預(yù)。參數(shù)如下：疏密波，頻率1/20 Hz，刺激強(qiáng)度1，電針干預(yù)30 min/次，1次/d，共干預(yù)28 d。假手術(shù)組、模型組大鼠每日同等抓取，但不進(jìn)行其他干預(yù)。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1空間學(xué)習(xí)記憶能力 采用Barnes 迷宮測試評價(jià)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力。Barnes迷宮測試主要分為適應(yīng)階段、學(xué)習(xí)階段、測試階段3 個階段［9］。在每次實(shí)驗(yàn)前用75%的消毒酒精擦拭平臺、逃避盒各1遍，去除殘留氣味，并將第1層平臺旋轉(zhuǎn)，避免大鼠因?yàn)槲兜蓝业教颖芎?。記錄逃避潛伏期、目?biāo)象限持續(xù)時間百分比。

1.3.2空間工作記憶能力 采用Y迷宮測試評價(jià)大鼠空間工作記憶能力。實(shí)驗(yàn)開始時將大鼠置于Y迷宮中央?yún)^(qū)域，讓其在Y 迷宮中自由探索8 min，并記錄其進(jìn)入各臂的順序，只有連續(xù)進(jìn)入3 個不同的臂時計(jì)為1次正確的交替探索，待8 min結(jié)束后將實(shí)驗(yàn)動物拿出Y迷宮，并放回原籠飼養(yǎng)；然后將Y迷宮用消毒酒精擦拭1 遍，以去除殘留氣味的影響。交替率計(jì)算方法：Y 迷宮交替率＝正確交替次數(shù)/（總交替次數(shù)－2）×100%。

1.3.3腦區(qū)功能活動分析 采用小動物磁共振掃描儀（德國Bruker，7.0 T）對各組大鼠進(jìn)行BOLDfMRI掃描。BOLD-fMRI掃描參數(shù)如下：回波時間＝28 ms，重復(fù)時間＝2 000 ms，視野大?。?2 mm×32 mm，重復(fù)次數(shù)＝1，圖像矩陣大?。?28×128，層數(shù)＝21，層厚＝1 mm，no slice gap，時間點(diǎn)＝200，掃描時間＝6 min。

采用靜息態(tài)功能磁共振數(shù)據(jù)處理助手軟件包（Data Processing Assistant for Resting-State fMRI，DPARSF）和統(tǒng)計(jì)參數(shù)圖（Statistical Parametric Map?ping，SPM）進(jìn)行腦區(qū)局部一致性分析，數(shù)據(jù)處理包括去除前10個時間點(diǎn)、時間校正、頭動校正、空間標(biāo)準(zhǔn)化、去線性漂移、濾波（0.01～0.1 Hz）、局部一致性（regional homogeneity，ReHo）值的計(jì)算和平滑處理。采用單因素方差分析進(jìn)行各組大鼠腦區(qū)局部一致性變化比較。P＜0.005，clusters＞10 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3.4基因表達(dá)譜分析 每組選擇4 只大鼠提取左、右側(cè)海馬總RNA，采用Agilent mRNA 表達(dá)譜芯片分析海馬差異mRNA 表達(dá)譜，包括體外擴(kuò)增、熒光標(biāo)記、芯片雜交和數(shù)據(jù)預(yù)處理分析以及Gene?Spring GX 軟件計(jì)算基因表達(dá)差異分析，每個數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化和質(zhì)控分析，采用Cluster 3.0 軟件進(jìn)行聚類分析和Circos圖形化展示差異表達(dá)基因。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布采用（）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t法進(jìn)行分析。P＜0.05視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組空間學(xué)習(xí)記憶能力比較

Barnes 迷宮空間探索試驗(yàn)結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠逃避潛伏期明顯更高（P＜0.05）；與模型組比較，電針組逃避潛伏期明顯更低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠目標(biāo)象限持續(xù)時間百分比明顯降低（P＜0.05）；與模型組比較，電針組目標(biāo)象限持續(xù)時間百分比明顯增加（P＜0.05）。見表1～2。

表1 3組Barnes實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期比較（） 秒Table1 Comparison of latency in Barnes maze in three groups（） s

表1 3組Barnes實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期比較（） 秒Table1 Comparison of latency in Barnes maze in three groups（） s

注：與假手術(shù)組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。Notes:Compared with the sham operation group,1)P<0.05;compared with the model group,2)P<0.05.

表2 3組目標(biāo)象限持續(xù)時間百分比比較（） %Table2 Comparison of the percentage of duration in the target quadrant in three group（） %

表2 3組目標(biāo)象限持續(xù)時間百分比比較（） %Table2 Comparison of the percentage of duration in the target quadrant in three group（） %

注：與假手術(shù)組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。Notes:Compared with the sham operation group,1)P<0.05;com?pared with the model group,2)P<0.05.

2.2 3組空間工作記憶能力比較

Y 迷宮測試結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組Y 迷宮交替率明顯下降（P＜0.05）；與模型組比較，電針組Y 迷宮交替率明顯升高（P＜0.05）。這表明電針百會、神庭穴可以提升VCI 大鼠的Y 迷宮交替率，改善VCI大鼠空間工作記憶能力。見表3。

表3 3組干預(yù)后Y迷宮交替率比較（） %Table3 Comparison of the alternation rate of Y-maze after intervention in three groups（） %

表3 3組干預(yù)后Y迷宮交替率比較（） %Table3 Comparison of the alternation rate of Y-maze after intervention in three groups（） %

注：與假手術(shù)組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。Notes:Compared with the sham operation group,1)P<0.05;com?pared with the model group,2)P<0.05.

2.3 3組海馬局部一致性比較

研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組雙側(cè)海馬、前額葉、紋狀體及丘腦背外側(cè)核等腦區(qū)的局部一致性明顯減弱（P＜0.005）；與模型組比較，電針組雙側(cè)前額葉、海馬及梨狀皮層腦區(qū)的局部一致性明顯增強(qiáng)（P＜0.005）。見表4、圖1～2。

圖1 模型組與假手術(shù)組腦區(qū)局部一致性比較Figure 1 Comparison of ReHo of brain regions between the model group and the sham operation group

表4 3組ReHo值比較Table4 Comparison of ReHo in three groups

圖2 電針組與模型組腦區(qū)局部一致性比較Figure 2 Comparison of ReHo of brain regions between the electroacupuncture group and the model group

2.4 3組海馬基因表達(dá)譜分析

海馬組織基因表達(dá)譜芯片分析結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組海馬mRNA 差異表達(dá)＞2 倍的基因共705 個（P＜0.05），其中195 個基因（Sytl1、Chrna7、Gprc5a、Trpv6、Klhl14、Npsr1、Myh3、Galnt3、Nr4a1、Bmp3、Egr2等突觸結(jié)構(gòu)蛋白、乙酰膽堿受體、早期即刻基因相關(guān)分子）表達(dá)下調(diào)；510 個基因（In?sl6、Efcab1、Akr1b1、Tagln、Glrb、Akr1c13、Kcne1L、Ubap1 等炎癥、氧化應(yīng)激、趨化因子、自噬、凋亡、泛素化相關(guān)分子）表達(dá)上調(diào)。與模型組比較，電針組海馬mRNA差異表達(dá)＞2倍共399個基因（P＜0.05），其中166 個基因（Klhl14、Bmp3、Npsr1、Cacna1e 等鈣通道蛋白、能量代謝、免疫調(diào)節(jié)相關(guān)分子）表達(dá)上調(diào)；233個基因（Insl6、Ube2k、Cdkn1c、Camp、Upk1b等炎癥、細(xì)胞周期抑制、泛素化相關(guān)分子）表達(dá)下調(diào)。見圖3～5、表5。

表5 2組比較部分差異mRNA表達(dá)結(jié)果Table 5 Differential mRNA expression results in the pair?wise comparison

圖3 3組海馬mRNA差異表達(dá)的聚類分析Figure 3 Cluster analysis of differential expression of hippocampal mRNA in three groups

3 討論

血管性認(rèn)知障礙多發(fā)于60歲以上老年人群，其發(fā)病率高達(dá)24.2%［10］。尋找治療血管性認(rèn)知障礙的適宜治療方案是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。針灸作為血管性認(rèn)知障礙的一種行之有效的康復(fù)方法，朱永磊等［11］采用“從督論治”針刺法治療腦卒中后認(rèn)知功能障礙40例，發(fā)現(xiàn)“從督論治”針刺可顯著提高簡易精神狀態(tài)評分。本研究團(tuán)隊(duì)前期研究提出“臟腑為用、督脈為樞”促進(jìn)認(rèn)知功能恢復(fù)的中醫(yī)康復(fù)理論，結(jié)合中醫(yī)古籍梳理，提出了“通督調(diào)神”針刺“百會”“神庭”穴作為治療認(rèn)知障礙的針刺康復(fù)方案，經(jīng)臨床隨機(jī)對照試驗(yàn)證實(shí)，“通督調(diào)神”針刺“百會”“神庭”穴可改善血管性認(rèn)知障礙患者整體認(rèn)知功能和記憶功能［12-13］。

3.1 電針可以改善VCI大鼠認(rèn)知功能障礙

圖4 模型組與假手術(shù)組海馬mRNA差異表達(dá)情況Figure 4 Differential expression of hippocampal mRNA in the model group compared with the sham op?eration group

圖5 電針組與模型組海馬mRNA差異表達(dá)情況Figure 5 Differential expression of hippocampal mRNA in the electroacupuncture group compared with the model group

血管性認(rèn)知障礙會導(dǎo)致多種類型的認(rèn)知功能受損，主要集中于學(xué)習(xí)記憶功能及工作記憶功能受損［14-16］。本研究通過對VCI大鼠進(jìn)行認(rèn)知功能行為學(xué)的檢測，發(fā)現(xiàn)VCI 大鼠在Barnes 迷宮實(shí)驗(yàn)中逃避潛伏期上升，隨后的空間探索實(shí)驗(yàn)中，VCI大鼠搜尋逃避盒的軌跡雜亂無章，無法明確定位逃避盒所在的象限，而在Y 迷宮測試中，VCI 大鼠交替率顯著下降，表明VCI 大鼠出現(xiàn)空間學(xué)習(xí)記憶與工作記憶功能障礙，這與其他研究結(jié)果類似［15，17］。電針刺激百會、神庭穴后，VCI大鼠在Barnes 迷宮的逃避潛伏期明顯下降，其探索逃避盒所在區(qū)域的停留時間也明顯升高，這提示電針百會、神庭穴可以改善VCI大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶功能；此外，本研究Y迷宮交替率測試也發(fā)現(xiàn)電針百會、神庭穴可以改善VCI 大鼠空間工作記憶功能，與前期研究相一致［18］。目前大部分關(guān)于電針改善VCI大鼠認(rèn)知功能障礙的研究認(rèn)為其可能的機(jī)制在于調(diào)控相關(guān)腦區(qū)的蛋白質(zhì)表達(dá)進(jìn)而改善認(rèn)知功能［7-8］，而未對電針調(diào)控蛋白質(zhì)改變后相關(guān)腦區(qū)功能活動的變化進(jìn)行更深入的探索。因此，本研究擬利用BOLD-fMRI 技術(shù)進(jìn)一步揭示電針干預(yù)后VCI大鼠腦區(qū)功能活動的直接變化。

3.2 電針可以調(diào)控VCI大鼠腦區(qū)功能活動

局部一致性信號的強(qiáng)弱作為腦區(qū)功能活動高低的敏感性指標(biāo)之一，檢測腦區(qū)血流信號在時間序列上的一致性，通過腦部的血流信號可以間接反映神經(jīng)元活動的強(qiáng)弱［19］。本研究結(jié)果顯示，大鼠雙側(cè)頸總動脈結(jié)扎42 d 后，其雙側(cè)海馬、前額葉、紋狀體及丘腦背外側(cè)核均出現(xiàn)腦區(qū)活動局部一致性信號下降，這提示模型組大鼠在前額葉、海馬、紋狀體及丘腦背外側(cè)核均出現(xiàn)了神經(jīng)元活動減弱，這些腦區(qū)神經(jīng)元活動性的降低可能是VCI大鼠認(rèn)知功能下降的重要因素，與NATION 等［20-21］研究結(jié)果相似。而電針干預(yù)后海馬、前額葉、杏仁核及梨狀皮層均出現(xiàn)局部一致性信號上升，表明電針可以有效增強(qiáng)海馬、前額葉及梨狀皮層等腦區(qū)神經(jīng)元活動，恢復(fù)由全腦低灌注導(dǎo)致的神經(jīng)元功能缺損。海馬是調(diào)節(jié)記憶編碼和儲存的關(guān)鍵腦區(qū)，海馬內(nèi)含有一類可以根據(jù)動物在環(huán)境中特定位置而放電的位置細(xì)胞［22］。腹側(cè)、背側(cè)海馬與前額葉皮層神經(jīng)活動可以誘發(fā)theta 同步振蕩，從而調(diào)節(jié)空間記憶任務(wù)［23］。海馬-前額葉神經(jīng)環(huán)路參與了學(xué)習(xí)記憶與工作記憶功能的調(diào)控，其具體調(diào)控可能與該環(huán)路的亞區(qū)以及細(xì)胞類型有關(guān)［24-25］。本研究BOLD-fMRI 結(jié)果提示，電針很可能通過調(diào)控海馬、前額葉腦區(qū)活動改善血管性認(rèn)知障礙空間學(xué)習(xí)記憶與工作記憶功能。

3.3 電針可以調(diào)控VCI大鼠海馬基因表達(dá)

既往研究表明，血管性認(rèn)知障礙損傷的分子生物學(xué)機(jī)制極其復(fù)雜，與突觸結(jié)構(gòu)、功能相關(guān)蛋白丟失，神經(jīng)炎癥、細(xì)胞凋亡等相關(guān)分子表達(dá)異常密切相關(guān)［8，26］。研究表明，針刺可改善腦缺血損傷引起的認(rèn)知缺陷，抑制海馬氧化應(yīng)激、神經(jīng)元凋亡損傷，通過上調(diào)Trx-1 表達(dá)，抑制ASK1-JNK/p38 通路，降低IL-6 表達(dá)，促進(jìn)鈣離子釋放相關(guān)蛋白、突觸相關(guān)蛋白NMDA 受體、AMPA 受體等［7，27-28］。本研究通過全基因組芯片分析發(fā)現(xiàn)，電針增強(qiáng)血管性認(rèn)知障礙大鼠海馬Klhl14、Bmp3、Npsr1、Cacna1e 等鈣通道蛋白、能量代謝、免疫調(diào)節(jié)相關(guān)分子的166 個基因表達(dá)，并抑制Insl6、Ube2k、Cdkn1c、Camp、Upk1b 等炎癥、細(xì)胞周期抑制、泛素化相關(guān)分子的233個基因表達(dá)。這說明，電針干預(yù)后VCI 大鼠多個通路的相關(guān)基因表達(dá)發(fā)生改變，提示其電針存在調(diào)控后續(xù)相關(guān)蛋白表達(dá)的可能性。但針刺治療血管性認(rèn)知障礙的具體機(jī)制較為復(fù)雜，很可能是通過多靶點(diǎn)、多途徑發(fā)揮作用，下一步還需要開展更深入、全面的研究探討相關(guān)通路對于腦區(qū)功能活動的具體調(diào)控作用。

4 小 結(jié)

本研究證實(shí)電針百會、神庭穴可以改善血管性認(rèn)知障礙大鼠認(rèn)知功能，其機(jī)制可能與增強(qiáng)海馬、前額葉等腦區(qū)功能以及調(diào)控鈣離子、能量代謝相關(guān)分子的表達(dá)參與調(diào)節(jié)神經(jīng)活動等有關(guān)，但其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。