劉敏 米永杰 劉洪 陳登榜 代呂霞 代娟 李飛燕 何煦 張丹

（1. 成都醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，四川 成都 610500；2. 成都醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610500；3. 成都中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院影像教研室，四川 成都 610016.）

據(jù)報(bào)道，全世界大約75%的早期妊娠失敗源于胚胎植入的異常[1,2]。盡管體外受精和胚胎移植技術(shù)在治療不孕不育有較大進(jìn)展，但是胚胎植入率仍然不理想[3]。

研究胚胎早期發(fā)育和胚胎著床有助于解決這一難題。然而對(duì)于人類胚胎著床研究由于受到倫理的限制，因而該領(lǐng)域的研究主要在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，特別是小鼠中進(jìn)行。小鼠囊胚黏附于子宮內(nèi)膜上皮后，圍繞囊胚周圍的基質(zhì)細(xì)胞快速增殖與分化，從而促使囊胚完全植入子宮內(nèi)膜，該過(guò)程稱為蛻膜化，蛻膜化是早期妊娠的重要過(guò)程[4,5]。

分布于細(xì)胞膜的水通道蛋白(Aquaporins，AQPs)是一種六次跨膜蛋白，AQPs通過(guò)介導(dǎo)水轉(zhuǎn)運(yùn)來(lái)維持內(nèi)環(huán)境的平衡。在已發(fā)現(xiàn)的16種AQPs (AQP0-AQP14,16) 中，第二類為甘油水通道蛋白，這類AQPs可以介導(dǎo)甘油等的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)[6]，AQP7屬于甘油水通道蛋白。

研究發(fā)現(xiàn)，在腸上皮和皮膚腫瘤的發(fā)生等細(xì)胞增殖速度快的組織中，甘油水通道蛋白跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的甘油通過(guò)代謝為這些組織提供細(xì)胞增殖所需要的能量[7,8]。而子宮內(nèi)膜蛻膜化過(guò)程與腫瘤局部能量代謝相似，子宮蛻膜細(xì)胞的增殖和分化需要大量的能量供應(yīng)，因此我們推測(cè)AQP7參與了小鼠子宮蛻膜化的發(fā)生。

我們采用孕小鼠模型，分離原代小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞建立體外蛻膜化模型，研究AQP7在小鼠子宮內(nèi)膜中的表達(dá)情況，AQP7在體外誘導(dǎo)蛻膜化模型中的表達(dá)，以及卵巢激素對(duì)AQP7的調(diào)節(jié)作用，以探討AQP7在子宮基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化中的作用。

1 材料與方法

1.1 構(gòu)建孕小鼠模型

實(shí)驗(yàn)所用ICR小鼠（7～9周周齡）均購(gòu)于成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物股份有限公司。雌性與雄性小鼠按2：1比例合籠。本研究通過(guò)成都醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，操作符合關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物指導(dǎo)性意見(jiàn)的要求。

1.2 小鼠原代子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞（ESCs）分離培養(yǎng)及體外誘導(dǎo)蛻膜化模型的建立

將25 g·L-1的胰酶和6g/l的分散酶加入至孕小鼠子宮組織塊中，置4℃孵育60 min，室溫30 min；使用含1%胎牛血清的D-Hank’s 液終止消化，收集沉降組織。加入0.05%的膠原酶I消化組織塊，37℃孵育20 min；在沉積組織中加入PBS 液，收集上清液，1500 rpm離心5分鐘，沉淀即為基質(zhì)細(xì)胞。

基質(zhì)細(xì)胞用DMEM/F12培養(yǎng)基重懸，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；細(xì)胞貼壁后，加入10-6M 醋酸甲羥孕酮 和 10-8M 17β-雌二醇以體外誘導(dǎo)基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化。

1.3 采用RT-qPCR 檢測(cè)子宮內(nèi)膜蛻膜細(xì)胞中AQP7、 prl8a2的mRNA表達(dá)

使用Trizol試劑提取細(xì)胞的總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒中的實(shí)驗(yàn)步驟構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄體系，獲得cDNA產(chǎn)物；擴(kuò)增反應(yīng)在熒光定量PCR 儀（型號(hào)PIKORed 96，ThermoFisher儀器有限公司，美國(guó)）上進(jìn)行，反應(yīng)結(jié)束后，采用MUS β-actin作為內(nèi)參基因，利用SDS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

所有引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計(jì)合成，并以ULTRAPAGE純化：AQP7 上游引物5'-3' GCTTGGTCTGCTGCTTCAG，下游引物5'-3' GGGGTTCGAGTGATGCATTT；Prl8a2 上游引物 5'-3' AGCCAGAAATCACTGCCACT，下游引物5'-3' TGATCCATGCACCCATAAAA；MUSβ-actin 上游引物5'-3' TCAGGAGGAGCAATGATCTTG，下游引物5'-3' TCCTCCCTGGAGAAGAGCTA。

1.4 免疫組織化學(xué)染色

收集孕小鼠子宮，石蠟包埋切片，將脫蠟后的切片加入3%雙氧水置室溫10min，PBS洗3次；高溫抗原修復(fù)切片后冷卻至室溫，滴加山羊血清以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)；滴加一抗（兔抗小鼠AQP7多克隆抗體1:200，Proteintech，美國(guó)），4℃過(guò)夜；滴加生物素化二抗IgG工作液，37℃ 30 min；二氨基聯(lián)苯氨液染色后采用蘇木素輕度復(fù)染，顯微鏡下觀察AQP7在子宮內(nèi)膜的分布特點(diǎn)。

1.5 細(xì)胞體外激素處理

將體外培養(yǎng)的子宮基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行分組，分別加入含有雌二醇 E2（10 nM），孕酮P4（1μM）以及E2（10n M）和P4（1μM）的DMEM/F12 培養(yǎng)基，處理24小時(shí)后收集細(xì)胞。

用E2的拮抗劑ICI 182,780（1μM）和 P4的拮抗劑RU486（1μM）預(yù)處理基質(zhì)細(xì)胞2小時(shí)后，再用E2和P4處理24小時(shí)后收集細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)樣品均一式三份，每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)檢測(cè)三次。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS20.0軟件分析數(shù)據(jù)。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較兩組間差異，在比較兩個(gè)以上樣本間時(shí)，以單因素方差分析組間差異。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AQP7在小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)具有明顯的時(shí)空特點(diǎn)

體外分離孕4～8天小鼠子宮基質(zhì)細(xì)胞，采用RT-PCR檢測(cè)基質(zhì)細(xì)胞AQP7 mRNA的表達(dá)情況。檢測(cè)結(jié)果如圖1A所示，AQP7 mRNA在孕4～8天的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)逐漸升高。

收集孕4～8天小鼠子宮，采用免疫組化染色檢測(cè)AQP7蛋白在子宮內(nèi)膜組織的表達(dá)，結(jié)果（圖1B、圖1C）顯示，在孕第4天的著床窗口時(shí)期，子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞幾乎不表達(dá)AQP7。

圖1 AQP7在孕早期小鼠子宮內(nèi)膜上皮的表達(dá)

隨著孕激素分泌增加，在孕第5天，AQP7主要表達(dá)于子宮內(nèi)膜著床胚胎周圍的初級(jí)蛻膜區(qū)（PDZ）基質(zhì)細(xì)胞中。在孕第6天和孕第7天，隨著孕激素進(jìn)一步分泌和基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化進(jìn)程，子宮內(nèi)膜蛻膜化的基質(zhì)細(xì)胞中AQP7的表達(dá)明顯增多，免疫組化染色呈強(qiáng)陽(yáng)性。

而孕第8天，子宮內(nèi)膜次級(jí)蛻膜區(qū)SDZ蛻膜細(xì)胞中，AQP7的表達(dá)有所減弱。從孕第5天到第8天，隨著蛻膜化的進(jìn)程，子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞中AQP7表達(dá)模式表明雌、孕激素可以調(diào)節(jié)AQP7蛋白的表達(dá)。

2.2 在體外誘導(dǎo)蛻膜化模型中AQP7在蛻膜細(xì)胞中的表達(dá)

分別于0 h、48 h、72 h和96 h，在體外分離培養(yǎng)的小鼠基質(zhì)細(xì)胞中加入10-6M 醋酸甲羥孕酮 和 10-8M 17β-雌二醇以誘導(dǎo)基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化，以建立體外誘導(dǎo)蛻膜化模型。

通過(guò)RT-PCR檢測(cè)小鼠蛻膜標(biāo)記物Prl8a2 mRNA在基質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)、以判斷基質(zhì)細(xì)胞蛻膜化的情況。

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在誘導(dǎo)蛻膜化后72 h和96 h小鼠基質(zhì)細(xì)胞中Prl8a2 mRNA表達(dá)顯著升高，以96 h時(shí)基質(zhì)細(xì)胞中Prl8a2 mRNA升高尤為明顯（圖2A），提示體外誘導(dǎo)蛻膜化模型建立。

隨后采用RT-PCR檢測(cè)在誘導(dǎo)蛻膜化不同時(shí)間點(diǎn)、基質(zhì)細(xì)胞中AQP7 mRNA的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在誘導(dǎo)蛻膜化后72 h和96h小鼠基質(zhì)細(xì)胞中AQP7 mRNA表達(dá)顯著升高，以96 h時(shí)基質(zhì)細(xì)胞中AQP7 mRNA升高尤為顯著（圖2B）。

圖2 體外誘導(dǎo)蛻膜化模型中蛻膜細(xì)胞AQP7的表達(dá)

2.3 卵巢E2和P4上調(diào)基質(zhì)細(xì)胞AQP7表達(dá)

將分離側(cè)小鼠孕5天的基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后分為：① E2組，分別在6小時(shí)、12小時(shí)和24小時(shí)加入0.01μmol?L-1E2； ② P4組，分別在6小時(shí)、12小時(shí)和24小時(shí)加入1 μmol?L-1P4； ③E2和P4聯(lián)合處理組，分別在6小時(shí)、12小時(shí)和24小時(shí)加入0.01μmol?L-1E2和1μmol?L-1P4。④用ER拮抗劑ICI 182,780（1 μM）和PR拮抗劑RU486（1 μM）預(yù)處理基質(zhì)細(xì)胞 2 小時(shí)后，再用E2和P4處理24小時(shí)。在不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞，RT-PCR檢測(cè)卵巢激素對(duì)基質(zhì)細(xì)胞AQP7的調(diào)控。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，E2組在不同的時(shí)間點(diǎn)、單獨(dú)加入E2后基質(zhì)細(xì)胞AQP7表達(dá)無(wú)明顯變化（圖3A）。而P4組在不同的時(shí)間點(diǎn)、單獨(dú)加入P4后，基質(zhì)細(xì)胞AQP7表達(dá)也無(wú)明顯變化（圖3B）。而與對(duì)照組比較，E2+P4組在E2和P4聯(lián)合作用6小時(shí)基質(zhì)細(xì)胞AQP7表達(dá)無(wú)明顯改變，作用12小時(shí)后基質(zhì)細(xì)胞AQP7表達(dá)開始升高（圖3C），作用24小時(shí)后基質(zhì)細(xì)胞AQP7表達(dá)進(jìn)一步顯著升高（圖3C），這表明E2和4P聯(lián)合作用可上調(diào)基質(zhì)細(xì)胞AQP7表達(dá)；且在E2和P4聯(lián)合作用24小時(shí)后，基質(zhì)細(xì)胞AQP7表達(dá)的升高能夠被拮抗劑ICI 182,780和拮抗劑RU486阻斷（圖3D）。

圖3 體外激素模型中卵巢激素對(duì)基質(zhì)細(xì)胞AQP表達(dá)的調(diào)控

3 討論

水通道蛋白（AQPs）是跨膜通道蛋白。到目前為止，至少發(fā)現(xiàn)12種AQPs在哺乳動(dòng)物的不同組織中有表達(dá)[9,10]。有關(guān)AQP7在子宮中的表達(dá)也有報(bào)道[11]。在體外培養(yǎng)的小鼠子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中檢測(cè)發(fā)現(xiàn)AQP7的表達(dá)顯著升高。Tanski D等研究中發(fā)現(xiàn)AQP7在豬的子宮內(nèi)膜腔上皮細(xì)胞中顯著升高[12]。彭在對(duì)孕小鼠進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，發(fā)現(xiàn)AQP7在子宮蛻膜組織中的表達(dá)顯著升高[13]。AQP7屬于甘油水通道蛋白中，甘油水通道蛋白可以介導(dǎo)甘油轉(zhuǎn)運(yùn)，甘油被證明是細(xì)胞增殖的替代能源，特別是在高代謝的組織中更為明顯[14]，這在哺乳動(dòng)物的生殖過(guò)程中起到了關(guān)鍵的作用[6]。

我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，孕早期小鼠子宮基質(zhì)細(xì)胞AQP7呈高表達(dá)，主要表達(dá)于子宮內(nèi)膜初級(jí)蛻膜區(qū)和次級(jí)蛻膜區(qū)。這些結(jié)果與彭的研究一致[13]。并且我們發(fā)現(xiàn)AQP7的表達(dá)模式與蛻膜化進(jìn)程密切相關(guān)，隨著蛻膜化的發(fā)展，AQP7的表達(dá)越顯著，表達(dá)范圍也更加廣泛，這表明雌、孕激素可以調(diào)節(jié)AQP7蛋白的表達(dá)。

AQP7在小鼠圍繞胚胎著床部位的蛻膜細(xì)胞中高表達(dá)的模式表明其在蛻膜化和胚胎著床中發(fā)揮了重要作用。隨后，我們分離小鼠子宮內(nèi)膜原代基質(zhì)細(xì)胞建立了體外誘導(dǎo)蛻膜化模型。在體外誘導(dǎo)的蛻膜細(xì)胞中AQP7同樣特異性地高表達(dá)。彭等進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在圍植入期，子宮中甘油含量和甘油激酶表達(dá)也隨蛻膜化進(jìn)程逐漸增加[13]。AQP7表達(dá)與子宮中甘油積累、甘油激酶表達(dá)協(xié)同增高的特異表達(dá)，因而認(rèn)為甘油可能是小鼠子宮蛻膜化過(guò)程中必要的能量物質(zhì)，AQP7很可能通過(guò)介導(dǎo)甘油轉(zhuǎn)運(yùn)而參與基質(zhì)細(xì)胞向蛻膜細(xì)胞的轉(zhuǎn)化[13]。

為進(jìn)一步探究雌、孕激素對(duì)子宮基質(zhì)細(xì)胞AQP7表達(dá)的影響，我們?cè)隗w外培養(yǎng)的孕小鼠的基質(zhì)細(xì)胞中加入E2和P4，采用 RT-PCR檢測(cè)卵巢激素對(duì)基質(zhì)細(xì)胞AQP7的調(diào)控。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)加入E2以及P4后、基質(zhì)細(xì)胞AQP7表達(dá)無(wú)明顯變化，表明雌激素和孕激素單獨(dú)作用對(duì)基質(zhì)細(xì)胞AQP7表達(dá)無(wú)明顯調(diào)控作用。而E2和P4聯(lián)合組在E2和P4聯(lián)合作用后，基質(zhì)細(xì)胞AQP7表達(dá)顯著升高，這表明E2和P4激素的聯(lián)合作用可上調(diào)基質(zhì)細(xì)胞AQP7的表達(dá)。并且我們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，E2和P4聯(lián)合調(diào)控的基質(zhì)細(xì)胞AQP7的升高能夠被雌激素受體的拮抗劑ICI182,780和孕激素受體的拮抗劑RU486阻斷，這提示雌二醇和孕酮可以通過(guò)其類固醇激素受體調(diào)控AQP7的表達(dá)。AQPs的表達(dá)可能受到各種調(diào)控因素的影響，除了雌、孕激素外，還可能受到細(xì)胞因子、激活信號(hào)等的作用。 Tanski, D等分離豬的子宮內(nèi)膜腔上皮細(xì)胞并體外培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)E2 聯(lián)合 H89（PKA抑制劑）、E2 聯(lián)合 PD98059（MAPK抑制劑）、P4聯(lián)合PD98059可以促使內(nèi)膜腔上皮細(xì)胞AQP7的表達(dá)增加[12]。這表明在排卵期，豬的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞AQP7的表達(dá)可能由雌二醇、孕酮通過(guò)PKA信號(hào)或者M(jìn)APK信號(hào)途徑調(diào)控，然而調(diào)控AQP7表達(dá)的機(jī)制還不清楚。

隨著蛻膜化的進(jìn)程，在孕早期小鼠子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞AQP7表達(dá)逐漸增加。在體外誘導(dǎo)的蛻膜細(xì)胞中AQP7同樣特異性地高表達(dá)。卵巢雌二醇和孕酮聯(lián)合作用可上調(diào)子宮基質(zhì)細(xì)胞AQP7表達(dá)。AQP7在小鼠圍繞胚胎著床部位蛻膜細(xì)胞的高表達(dá)模式，表明其在蛻膜化和孕早期胚胎著床中發(fā)揮著重要作用。而AQP7在蛻膜化中作用機(jī)制尚不清楚，需要在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步地探索。