李巧彤，程光宇，張 晨，趙 宇，孫士紅，馬 莉

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040；3.北京市豐臺(tái)區(qū)馬家堡社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，北京 100071)

血管性癡呆是常見于中老年人的以認(rèn)知功能顯著受損達(dá)到癡呆程度的疾病。有研究表明，60歲以上老年腦病患者中約有20%患有癡呆，其中血管性癡呆為首要病因，并且隨著年齡的增長(zhǎng)患病風(fēng)險(xiǎn)也隨之增加[1]。血管性癡呆的發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，目前認(rèn)為與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、神經(jīng)細(xì)胞凋亡等密切相關(guān)[2-3]。本實(shí)驗(yàn)旨在通過觀察電針法對(duì)血管性癡呆模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力、炎癥反應(yīng)因子及自噬相關(guān)蛋白的影響，探討電針治療血管性癡呆的作用機(jī)制，以期為臨床治療提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取健康雄性SPF級(jí)Wistar大鼠40只，體重(260±30)g，購(gòu)自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK(黑)2019002。飼養(yǎng)環(huán)境保持溫度(26±2)℃，相對(duì)濕度(55±5)%，給予充足水分，自然光源。

1.2主要藥物、試劑和儀器 吡拉西坦片(東北制藥集團(tuán)沈陽(yáng)第一制藥有限公司)；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)酶聯(lián)免疫試劑盒(北京博奧森生物技術(shù)有限公司),自噬微管相關(guān)蛋白輕鏈3(LC3)抗體、Beclin-1抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；0.25 mm×25 mm針灸針(貴州安迪藥業(yè)有限公司)，英迪牌KWD-800I脈沖針灸治療儀(廣州康哲醫(yī)療器械有限公司)， Morris水迷宮(上海欣軟信息科技有限公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 將大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、電針組、西藥組，每組10只。除假手術(shù)組外，其余組大鼠均采用改良2-VO法進(jìn)行血管性癡呆造模：造模前大鼠禁食12 h、禁水3 h。采用腹腔注射10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)麻醉大鼠，待生命體征平穩(wěn)后將其仰臥位固定在手術(shù)臺(tái)上，取頸部正中切口，分離皮下組織及頸部肌肉，充分暴露頸總動(dòng)脈，用動(dòng)脈止血夾夾閉頸總動(dòng)脈20 min后，將止血夾松開恢復(fù)供血10 min，再次夾閉頸總動(dòng)脈20 min，反復(fù)上述操作3次，最后一次血流恢復(fù)10 min結(jié)束后，用4號(hào)手術(shù)線將頸總動(dòng)脈永久結(jié)扎，縫合傷口并進(jìn)行傷口消毒。模型評(píng)定方法參考文獻(xiàn)[4]：手術(shù)后第5天進(jìn)行水迷宮適應(yīng)性訓(xùn)練,手術(shù)后第6天進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，以假手術(shù)造模大鼠航行定位實(shí)驗(yàn)中的逃避潛伏期均值為標(biāo)準(zhǔn)值，用血管性癡呆造模大鼠在航行定位實(shí)驗(yàn)中逃避潛伏期的均值與標(biāo)準(zhǔn)值先做差，再與標(biāo)準(zhǔn)值相除，結(jié)果大于20%即表示血管性癡呆模型造模成功。造模成功后，模型組及假手術(shù)組大鼠仰臥固定于鼠板上10 min，不針刺，固定結(jié)束后給予生理鹽水10 mL/kg灌胃；電針組大鼠根據(jù)于氏頭部分區(qū)法的分區(qū)標(biāo)準(zhǔn)選擇神庭至囟會(huì)及向其左、右各1寸的平行線進(jìn)行針刺治療，針刺方向?yàn)橄蚝笙路狡酱?，深度? mm左右，針刺后連接電針儀，設(shè)置為疏密波，頻率1～2 Hz，電針10 min后頭部繼續(xù)留針10 min, 針刺治療結(jié)束后給予生理鹽水10 mL/kg灌胃；西藥組大鼠仰臥固定于鼠板上10 min，固定結(jié)束后給予吡拉西坦液(將吡拉西坦片研磨后與蒸餾水按照40 mg/mL的濃度進(jìn)行配比)10 mL/kg灌胃。各組干預(yù)均1次/d，連續(xù)28 d。

1.4觀察指標(biāo)及方法

1.4.1Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 干預(yù)結(jié)束后，各組大鼠進(jìn)行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，其中第1～4天進(jìn)行定位航行試驗(yàn)，第5天進(jìn)行空間探索試驗(yàn)。每日將大鼠從標(biāo)記點(diǎn)放入水中(尾部先入水，頭朝池壁)，大鼠全身進(jìn)入水中后開始計(jì)時(shí)，找到平臺(tái)登臺(tái)10 s后停止計(jì)時(shí)，即為逃避潛伏期，每日每只大鼠進(jìn)行4次實(shí)驗(yàn)，取平均值。第5天撤去平臺(tái)后將大鼠從第一象限放入水中，記錄大鼠2 min中內(nèi)穿越原平臺(tái)次數(shù)。

1.4.2海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu) 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)各組大鼠進(jìn)行麻醉、灌注、斷頭，取部分海馬組織，放入4%多聚甲醛溶液固定、脫水、透明、梯度浸泡后進(jìn)行HE染色，觀察各組大鼠海馬CA1區(qū)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.4.3海馬組織中TNF-α、IL-1β、IL-10含量取各組大鼠海馬組織，制備成海馬組織勻漿，4 ℃下3 000 r/min(離心半徑6.0 cm)離心10 min，取上清液分裝，參照酶聯(lián)免疫試劑盒測(cè)定TNF-α、IL-1β、IL-10含量。

1.4.4海馬組織中Beclin-1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ表達(dá)量 采用Western blot法檢測(cè)：取海馬組織，加入適量細(xì)胞裂解液，用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)將細(xì)胞打碎成勻漿，抽取組織勻漿，加入2倍體積的蛋白抽提液顛倒混勻后，放入4 ℃或室溫靜置10 min，4 ℃下12 000 r/min(離心半徑6.0 cm)離心10 min后，棄去上下兩相液體，中間為蛋白膜，管中加入緩沖液，置入95 ℃水浴箱10 min左右，4 ℃下12 000 r/min(離心半徑6.0 cm) 離心5 min，4 ℃過夜。根據(jù)BCA試劑盒使用數(shù)明書測(cè)定蛋白濃度并定量；凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后加入一抗兔抗LC3、Beclin-1以及內(nèi)參GAPDH孵育過夜，二抗孵育，顯影曝光，導(dǎo)出圖像，并用Image J軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度分析，目的蛋白與內(nèi)參GAPGH的灰度比值代表相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠Morris水迷宮學(xué)習(xí)記憶能力比較 假手術(shù)組、電針組、西藥組大鼠逃避潛伏期均明顯短于模型組(P均<0.05)，穿越平臺(tái)次數(shù)均明顯多于模型組(P均<0.05)，電針組大鼠逃避潛伏期、穿越平臺(tái)次數(shù)與西藥組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見表1。

表1 假手術(shù)組和血管性癡呆各組大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期和穿越平臺(tái)次數(shù)比較

2.2各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)比較假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，分布均勻，排列整齊，細(xì)胞核飽滿清晰，細(xì)胞質(zhì)豐富，無明顯神經(jīng)元死亡；模型組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，分布混亂，排列疏松，細(xì)胞核固縮，胞漿渾濁，神經(jīng)元明顯缺失；與模型組比較，電針組和西藥組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)較規(guī)則，分布較均勻，排列較緊密，核膜核仁較清楚，可見少量細(xì)胞核固縮，壞死神經(jīng)元較少，電針組和西藥組差別不明顯。見圖1～4。

圖1 假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)(×400)

2.3各組大鼠海馬組織中TNF-α、IL-1β、IL-10含量比較 假手術(shù)組、電針組、西藥組大鼠海馬組織中TNF-α、IL-1β含量均明顯低于模型組(P均<0.05)，電針組與西藥組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；模型組大鼠海馬組織中IL-10含量明顯高于假手術(shù)組(P<0.05)，電針組和西藥組均明顯高于模型組(P均<0.05)，電針組與西藥組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

圖2 模型組血管癡呆性大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)(×400)

圖3 電針組血管癡呆性大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)(×400)

圖4 西藥組血管癡呆性大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)(×400)

表2 假手術(shù)組和血管性癡呆各組大鼠海馬組織中TNF-α、IL-1β、IL-10含量比較

2.4各組大鼠海馬組織中Beclin-1相對(duì)表達(dá)量及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比較 假手術(shù)組、電針組、西藥組大鼠海馬組織中Beclin-1相對(duì)表達(dá)量及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ均明顯低于模型組(P均<0.05)，電針組與西藥組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見圖5及圖6。

圖5 假手術(shù)組和血管性癡呆各組大鼠海馬組織中Beclin-1、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ表達(dá)情況

圖6 假手術(shù)組和血管性癡呆各組大鼠海馬組織中Beclin-1相對(duì)表達(dá)量及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比較

3 討 論

血管性癡呆在中醫(yī)中屬于“呆病”“癡呆”“善忘”等范疇，其病位在腦?！夺t(yī)林改錯(cuò)》中提出了“靈機(jī)記性，不在心在腦”?！额愖C治裁·健忘》亦提出“老人健忘者，腦漸空也”。于氏頭針是于致順教授通過多年臨床經(jīng)驗(yàn)與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)總結(jié)而出的針刺方法，該針法將頭部分為七區(qū)，并通過叢刺、長(zhǎng)留針和間斷行針從而產(chǎn)生“場(chǎng)”，使針刺的刺激效果更大，針刺范圍更廣。近年來動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，頭穴叢刺法可以通過下調(diào)血管性癡呆大鼠p-PERK、p-elF2a、p-p38MAPK蛋白表達(dá),增加海馬乙酰膽堿(Ach)、多巴胺(DA)、5-羥色胺(5-HT)的含量，抑制炎癥反應(yīng)，減輕海馬神經(jīng)元突觸損傷，從而改善大鼠癡呆病情[5-7]。臨床研究表明，頭穴叢刺法可以降低血管性癡呆患者血清低氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)水平，調(diào)節(jié)血脂，改善患者認(rèn)知功能，提高生活質(zhì)量[8-10]。本實(shí)驗(yàn)選用神庭至囟會(huì)及向其左、右各1寸的平行線的方法進(jìn)行針刺治療，此法對(duì)前額葉進(jìn)行了強(qiáng)刺激，其中神庭穴主治神識(shí)病癥、癲疾風(fēng)癇，囟會(huì)穴具有疏風(fēng)醒腦、清熱安神之功效，故此法有醒腦開竅、填髓益智之功。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，電針組大鼠的逃避潛伏期明顯短于模型組，穿越平臺(tái)次數(shù)均明顯多于模型組，提示電針治療可以改善血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。

血管性癡呆是僅次于阿爾茨海默病的第二大常見癡呆類型，其發(fā)病特點(diǎn)為大腦缺血后引起腦組織炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激等一系列反應(yīng)，進(jìn)一步造成腦損傷而導(dǎo)致認(rèn)知功能異常[11]。參與炎性反應(yīng)的炎性免疫因子主要分為兩大類，一種為促炎細(xì)胞因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6等；另一種為抗炎細(xì)胞因子，如IL-4、IL-10等[12-13]。TNF-α是促炎反應(yīng)的起始因子之一，可以促進(jìn)T細(xì)胞產(chǎn)生各種炎癥因子[14]，腦組織缺血發(fā)生時(shí)TNF-α含量明顯提高，可加重腦組織損傷[15]。IL-1β具有多效活性，可以通過TNF-α刺激內(nèi)皮細(xì)胞合成而來，兩者共同作用時(shí)可導(dǎo)致腦損傷加劇[16]。楊波等[17]研究發(fā)現(xiàn)，血管性癡呆患者血清IL-6、IL-8水平較正常人明顯增高，說明炎癥反應(yīng)與血管性癡呆相關(guān)。梁云云等[18]研究報(bào)道，銀杏內(nèi)酯聯(lián)合高壓氧治療可通過降低血清炎癥因子水平而改善血管性癡呆患者認(rèn)知能力。周雨慧等[19]研究表明不同劑量地黃飲子加減方可降低血管性癡呆大鼠腦組織中IL-6、IL-1β、TNF-α含量，改善大鼠的學(xué)習(xí)及認(rèn)知能力。IL-10為小膠質(zhì)細(xì)胞分泌而成的一種抗炎因子，可以通過抑制單核巨噬細(xì)胞釋放炎性介質(zhì)，從而抑制炎癥反應(yīng)[20]；其在神經(jīng)元穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞存活中起重要作用，并通過與腦中神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞群體上存在的特定細(xì)胞表面受體相互作用來介導(dǎo)其對(duì)細(xì)胞的作用[21]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，電針組大鼠海馬組織中TNF-α、IL-1β含量均明顯低于模型組，而IL-10含量明顯高于模型組，說明電針具有抑制炎癥反應(yīng)的作用。

自噬是細(xì)胞自我消化的過程，是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的重要途徑[22]。然而在應(yīng)激狀態(tài)下，自噬是一把雙刃劍，一方面自噬可以促進(jìn)細(xì)胞生存，清除受損細(xì)胞和異常蛋白；另一方面，當(dāng)自噬過度發(fā)生時(shí)可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)重要成分被消除，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。Beclin-1是自噬過程中的關(guān)鍵蛋白之一，是首個(gè)被確認(rèn)介導(dǎo)哺乳細(xì)胞自噬過程的基因，參與自噬的起始階段。LC3被認(rèn)為是自噬體形成起始階段的重要蛋白，與Beclin-1蛋白共同參與自噬體的形成。自噬未發(fā)生時(shí)，LC3的C末端被Atg4修飾后產(chǎn)生LC3-Ⅰ；而當(dāng)自噬發(fā)生時(shí)，LC3-Ⅰ進(jìn)一步活化轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘?LC3-Ⅱ。因此， LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值可以反映自噬的發(fā)生。劉斌等[23]研究表明，血管性癡呆大鼠術(shù)后CA1區(qū)Beclin-1蛋白表達(dá)水平及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明顯高于假手術(shù)組，自噬抑制組兩種蛋白表達(dá)均較血管性癡呆組下降，表明自噬在血管性癡呆發(fā)病中起重要作用，自噬抑制劑的干預(yù)能明顯改善血管性癡呆大鼠的學(xué)習(xí)及記憶能力。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠海馬組織中Beclin-1表達(dá)量及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ均明顯高于假手術(shù)組，說明血管性癡呆大鼠發(fā)生自噬；電針組大鼠海馬組織中Beclin-1表達(dá)量及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ均明顯低于模型組，說明電針治療可以抑制血管性癡呆自噬反應(yīng)，減輕腦損傷。

綜上所述，電針治療可以降低血管性癡呆大鼠海馬組織中TNF-α、IL-1β的含量及Beclin-1的表達(dá)量和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ，提高IL-10的含量，提示電針治療可以抑制炎癥反應(yīng)和自噬的發(fā)生，從而達(dá)到改善血管性癡呆大鼠認(rèn)知能力及保護(hù)腦組織的作用。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。