成家飛，徐 藝，顧培青，朱 磊，曹婷婷，張 露，李 萍，孫 心，馮 皖，沈 洪

(南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210000)

腸纖維化是炎癥性腸病的嚴重并發(fā)癥之一，超過40%的克羅恩病患者和約5%的潰瘍性結腸炎患者會發(fā)生腸纖維化[1]。目前，相對于炎癥性腸病腸道炎癥方面研究的突飛猛進，抗炎治療取得的長足進步，抗腸纖維化治療進展緩慢。中醫(yī)認為炎癥性腸病多因濕熱之邪壅滯腸道，與氣血相搏結，腸絡受損，氣凝血滯，血瘀阻絡，發(fā)為腹瀉、腹痛，甚至腸瘺，其病機關鍵是濕熱瘀阻。從病情發(fā)展看，多經歷“由實而虛”“由氣入血及絡”的動態(tài)變化。炎癥性腸病腸纖維化的基本病理改變是細胞外基質(ECM)尤其是膠原的過度沉積，與絡病學說中濕熱阻絡類似，故可將其歸屬中醫(yī)“絡病”范疇。中醫(yī)藥已成為治療炎癥性腸病的重要方法之一，對防治炎癥性腸病腸纖維化有獨特的優(yōu)勢，但其作用靶點尚不十分清楚。過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)系配體激活的核轉錄因子超家族的一員，在脂類代謝、免疫調節(jié)及炎癥反應等過程中起著十分重要的作用[2]。PPAR-γ是PPARs亞型之一，在許多器官中具有抗炎和抗纖維化作用[3-4]，但是其在腸纖維化中的確切作用尚不清楚，在腸纖維化進程中的動態(tài)變化亦沒有報道。故本研究采用三硝基苯磺酸(TNBS)建立小鼠腸纖維化模型，觀察PPAR-γ在腸纖維化過程中的動態(tài)變化，并分析其與膠原表達的相關性，為闡明PPAR-γ在腸纖維化中的作用以及中醫(yī)藥干預炎癥性腸病腸纖維化的靶點提供一些實驗依據。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 雄性BALB/c小鼠90只，SPF級，體重20～24 g，動物合格證編號：SCXK(滬)2017-0005。飼養(yǎng)環(huán)境:溫度20～26 ℃,相對濕度為40%～70%。

1.2試劑 5%TNBS(Sigma公司)，HE染液套裝(Servicebio公司)，Masson染液套裝(Servicebio公司)，Ⅰ型膠原α2(COL1A2)抗體(Abcam公司)，PPAR-γ抗體(正能生物公司)，RNA引物(上海擎熙生物科技有限公司)。

1.3儀器與設備 熒光定量PCR儀(ABI，7300)，正置熒光顯微鏡(OLYMPUS，BX51)，電泳儀(Bio-rad， Basic)， 全自動化學發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(天能，Tanon-4600SF)，臺式高速冷凍型微量離心機(DragonLab，D3024R)，超微量分光光度計(Thermo，NanoDrop2000)。

1.4實驗方法 將90只BALB/c小鼠隨機分為對照組和造模1周組、造模2周組、造模3周組、造模4周組、造模5周組、造模6周組、造模7周組、造模8周組，每組10只。造模各組小鼠參考Lawrance等[5]的研究進行造模：禁食，異氟烷麻醉，從肛門插入醫(yī)用聚乙烯管至距肛緣3 cm，每周1次灌入不同劑量的TNBS乙醇溶液(第1周和第2周均為0.5 mg，第3周和第4周均為0.75 mg，第5周和第6周均為1.0 mg)，保持肛門高位3 min，保證TNBS乙醇溶液不會立刻從肛門流出。對照組小鼠給予等體積的0.9%氯化鈉溶液灌腸，其余過程均相同。

1.5檢測指標及方法

1.5.1結腸長度及重量 對照組于灌腸8周、造模各組于造模相應時間點，采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠后處死，取肛門至回盲的腸段，測量長度并稱重。

1.5.2結腸組織學形態(tài) 取各組小鼠結腸病變明顯處腸管，4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，用于HE染色、Masson染色，電子顯微鏡下觀察結腸組織學形態(tài)。

1.5.3總膠原含量 采用化學比色法檢測：取液氮冷凍的結腸組織約30 mg，加入300 μL的胃蛋白酶冰醋酸溶液，4 ℃孵育過夜；3 000×g離心10 min后取上清液100 μL；加入1 mL Sircol染料，獲得膠原-染料復合物；13 000×g離心10 min；加入750 μL洗滌液；13 000×g離心10 min；加入染料釋放劑，將復合物中的染料釋放出來；取200 μL樣品，用分光光度計測定在556 nm處的吸光度。。

1.5.4結腸組織中PPAR-γ、COL1A2蛋白表達檢測 采用Western blot法檢測：取適量結腸組織，提取蛋白并定量，蛋白上樣15 μg/孔；5% SDS-PAGE電泳分離，電泳條件為80 V 20 min，120 V跑至膠底附近；300 mA轉膜60 min，將蛋白轉印至PVDF膜；5%BSA封閉2 h，TBST洗3次，每次10 min；孵育一抗(抗體濃度1∶1 000)，4 ℃過夜；回收一抗，TBST洗3次，每次10 min；孵育HRP結合二抗(抗體濃度1∶2 000)，室溫1 h；回收二抗，TBST洗3次，每次10 min；ECL試劑盒顯色，成像系統(tǒng)下成像，Image J軟件分析灰度值。

1.5.5結腸組織中PPAR-γ和COL1A2 mRNA表達檢測 采用RT-PCR法檢測：取適量結腸組織，提取總RNA，參照反轉錄試劑盒說明書反轉錄為cDNA，以甘油酸-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內參照，進行PCR擴增，引物序列：內參GAPDH上游為5’-GGTGTGAACCACGAGAAATATGAC-3’，下游為5’-TCATGAGCCCTTCCACAATG-3’；PPAR-γ上游為5’-GGAAGACCACTCGCATTCCTT-3’，下游為5’-GTAATCAGCAACCATTGGGTCA-3’；COL1A2上游為5’-GGTGAGCCTGGTCAAACGG-3’，下游為5’-ACTGTGTCCTTTCACGCCTTT-3’。結果分析采用ΔΔCT法，ΔCt=Ct目的基因-Ct內參，ΔΔCt=ΔCt處理組-ΔCt對照組，相對定量法(RQ)處理組=2-ΔΔCt，其中對照組RQ值設為1。以GAPDH為內參，依據2-ΔΔCt法計算各mRNA的相對表達量。

2 結 果

2.1各組小鼠結腸長度、結腸重量比較 與對照組比較，造模6周組、造模7周組、造模8周組小鼠的結腸長度均明顯縮短(P均<0.05)，造模7周組、造模8周組小鼠的結腸重量均明顯增加(P均<0.05)。見表1。

表1 對照組和腸纖維化造模各組小鼠結腸長度及結腸重量比較

2.2各組小鼠結腸組織病理學表現 HE染色和Masson染色發(fā)現，造模5周組、造模6周組、造模7周組、造模8周組小鼠腸壁可見明顯的炎癥細胞浸潤、腺體破壞、腺管扭曲、杯狀細胞減少及膠原纖維增生。見圖1及圖2。

圖1 對照組和腸纖維化造模各組小鼠結腸組織HE染色表現(×50)

圖2 對照組和腸纖維化造模各組小鼠結腸組織Masson染色表現(×50)

2.3各組小鼠結腸組織中總膠原含量比較 對照組小鼠結腸組織中總膠原含量為(6.82±0.35)μg/mg，造模1周組、造模2周組、造模3周組、造模4周組、造模5周組、造模6周組、造模7周組、造模8周組分別為(6.92±0.29)μg/mg、(6.95±0.27)μg/mg、(7.13±0.37)μg/mg、(7.52±0.42)μg/mg、(8.30±0.26)μg/mg、(9.31±0.38)μg/mg、(9.88±0.59)μg/mg、(10.47±0.50)μg/mg，造模5周組、造模6周組、造模7周組、造模8周組均明顯高于對照組(P均<0.05)。

2.4各組小鼠結腸組織中PPAR-γ和COL1A2蛋白表達情況 造模各組小鼠結腸組織中PPAR-γ蛋白表達量均明顯低于對照組(P均<0.05)，COL1A2蛋白表達量均明顯高于對照組(P均<0.05)，且分別呈遞減和遞增趨勢。見圖3。

圖3 對照組和腸纖維化造模各組小鼠結腸組織中PPAR-γ和COL1A2蛋白表達情況

2.5各組小鼠結腸組織中PPAR-γ和COL1A2 mRNA表達情況 造模1周組和造模2周組小鼠結腸組織中PPAR-γ和COL1A2 mRNA表達量與對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)；其余造模各組PPAR-γ mRNA表達量均明顯低于對照組(P均<0.05)，COL1A2 mRNA表達量均明顯高于對照組(P均<0.05)，且分別呈遞減和遞增趨勢。見圖4。

圖4 對照組和腸纖維化造模各組小鼠結腸組織中PPAR-γ和COL1A2 mRNA表達情況

2.6結腸組織中PPAR-γ和COL1A2表達的相關性 造模后小鼠結腸組織中PPAR-γ和COL1A2蛋白及mRNA的表達均呈負相關(r=-0.949，P<0.05;r=-0.870，P<0.05)。見圖5及圖6。

圖5 腸纖維化造模各組小鼠結腸組織中PPAR-γ和COL1A2蛋白表達的相關性

圖6 腸纖維化造模各組小鼠結腸組織中PPAR-γ和COL1A2 mRNA表達的相關性

3 討 論

炎癥性腸病包括潰瘍性結腸炎和克羅恩病，我國炎癥性腸病的發(fā)病率近年來呈明顯上升趨勢[6]?？肆_恩病的纖維化累及腸壁全層，統(tǒng)計發(fā)現約75%的克羅恩病患者在病程中至少接受一次手術，近半數是因為腸纖維化導致的腸狹窄和腸梗阻[7-8]。與克羅恩病相比，潰瘍性結腸炎的纖維化常局限于黏膜及黏膜下層，雖一般不引起腸道狹窄，但會引起結腸短縮、腸壁僵硬。炎癥性腸病腸纖維化的發(fā)生機制尚未完全闡明，對纖維性狹窄主要依賴內鏡和手術治療[9]，缺乏有效的、耐受性好的抗纖維化藥物，故明確腸纖維化的機制、尋找有效的治療靶點是目前研究的重點。

動物模型對于研究炎癥性腸病腸纖維化十分重要。本實驗采用TNBS小鼠模型，該模型操作簡單，經濟實用，重復性好，病變持續(xù)時間長，體現疾病急性向慢性轉化的過程，是一種經典的動物模型[10]。TNBS的劑量、給藥頻次、給藥方式及給藥時間參考Lawrance等[5]的研究，該方法自2003年問世以來，已被多位學者用于研究腸纖維化的發(fā)病機制或各種藥物對腸纖維化的療效[11-12]。本實驗結果顯示，從造模5周組開始，小鼠腸壁可見膠原纖維增生，結腸組織中總膠原含量增高；從造模6周組開始，小鼠的結腸長度明顯縮短；造模7周組、造模8周組小鼠的結腸重量明顯增加。這與既往相關研究結果一致。

PPARs是一種新型的核激素受體超家族，是調控眾多基因表達所必需的核受體。PPARs包括3種亞型:PPAR-α、PPAR-γ和PPAR-β/δ，它們具有不同的組織分布和功能。其中PPAR-γ是研究最廣泛的亞型，其廣泛分布于包括腸道在內的多個組織器官，參與調控脂質代謝、炎癥反應、細胞增殖和纖維化[13]。PPAR-γ的過表達可防止組織纖維化，而PPAR-γ的缺失則會增加纖維化[14]。多個實驗發(fā)現PPAR-γ激動劑可減輕心、肝、腎等器官的纖維化，PPAR-γ拮抗劑則能抵抗這種抗纖維化作用[15-17]。針對腸道，PPAR-γ激動劑亦表現出抗纖維化效應[18-19]。本課題組既往研究發(fā)現，TNBS單次灌腸造模3d后，大鼠結腸組織中PPAR-γ的表達受抑制，14d時其表達逐漸恢復[20]。Yang等[21]和Fu等[22]的研究也發(fā)現TNBS造模3d后PPAR-γ表達下調。本研究采用TNBS多次灌腸建立小鼠腸纖維化模型，結果發(fā)現隨造模時間延長，結腸組織中PPAR-γ表達逐漸減少，與既往研究結果不一致的可能原因是TNBS給藥的次數和觀察的時間點不一樣，既往的研究多觀察PPAR-γ在急性炎癥期的表達情況，而非在慢性纖維化進程中的動態(tài)表達情況。

腸纖維化主要表現為腸道ECM的過度沉積，膠原是ECM的主要成分，它有多個亞型，Ⅰ型膠原是最主要的亞型。本實驗結果發(fā)現，隨造模時間延長，結腸組織中COL1A2表達逐漸增加，相關性分析顯示PPAR-γ和COL1A2的表達呈負相關，提示PPAR-γ可能通過影響膠原的表達而參與腸纖維化進程。

綜上所述，TNBS灌腸誘導小鼠纖維化模型中，造模5周后出現明顯病變，結腸組織中總膠原含量增加，PPAR-γ隨造模時間延長而表達逐漸受抑制，且PPAR-γ與COL1A2的表達呈負相關，PPAR-γ在腸纖維化進程中可能起重要作用。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。