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        胞磷膽堿鈉堿降解雜質(zhì)的制備與結(jié)構(gòu)確證

        2021-12-21 10:17:08許云強(qiáng)孫宗彬程戰(zhàn)立劉金明李鐵健張貴民
        食品與藥品 2021年6期
        關(guān)鍵詞:胞磷冷凍干燥凍干

        王 鵬,許云強(qiáng),孫宗彬,程戰(zhàn)立,劉金明,李鐵健,張貴民

        (魯南制藥集團(tuán)股份有限公司 國(guó)家手性制藥工程技術(shù)研究中心,山東 臨沂 276000)

        胞磷膽堿鈉是合成細(xì)胞膜組分磷脂酰膽堿的中間體,為卵磷脂生物合成所需輔酶,目前廣泛應(yīng)用于急性顱腦損傷及手術(shù)后的意識(shí)障礙[1]。在胞磷膽堿鈉注射液的質(zhì)量研究中,發(fā)現(xiàn)相對(duì)保留時(shí)間1.8倍處有一未知雜質(zhì),其含量超過(guò)鑒定限,需對(duì)其進(jìn)行研究。通過(guò)強(qiáng)制降解實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),該雜質(zhì)含量在強(qiáng)堿性環(huán)境下能明顯變大,遂使用動(dòng)態(tài)軸向壓縮柱制備色譜系統(tǒng)對(duì)其進(jìn)行分離制備,并對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證,以期為胞磷膽堿鈉注射液的質(zhì)量研究提供依據(jù)。

        1 儀器與試藥

        1.1 儀器

        Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent);NP7000型DAC-50動(dòng)態(tài)軸向壓縮柱制備色譜系統(tǒng)(漢邦科技);85S2真空冷凍干燥機(jī)(美國(guó)Millrock);R-220 pro型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士Buchi);LAMBDA 365型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(美國(guó)PerkinElmer);Nicolet IS10傅里葉變換紅外光譜儀(美國(guó)Thermo);AV400型核磁共振譜儀(德國(guó)Bruker);SQD2液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Waters)。

        1.2 試藥

        胞磷膽堿鈉(山東新時(shí)代藥業(yè),批號(hào):183049);甲醇,異丙醇(德國(guó)Merck,色譜純);磷酸氫二鉀,磷酸(國(guó)藥集團(tuán),分析純);四丁基氫氧化銨(Sigma,分析純);氫氧化鈉,乙酸(西隴科學(xué),分析純);氘代二甲亞砜(美國(guó)CIL試劑,純度99.9 %);乙腈(濰坊中匯,制備級(jí));水為超純水。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 分析檢測(cè)條件

        色譜柱為Welch XB C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動(dòng)相為磷酸鹽緩沖液[0.1 mol/L磷酸氫二鉀溶液和四丁基氫氧化銨(取0.01 mol/L四丁基氫氧化銨,用磷酸調(diào)pH 4.5)等量混合]:甲醇=95:5],等度洗脫40 min;流速1 ml/min;柱溫25 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)276 nm。該方法用于粗品溶液和雜質(zhì)制備過(guò)程中的分析檢測(cè)。

        2.2 雜質(zhì)樣品溶液的配制

        取胞磷膽堿鈉適量,加水溶解并制成每1 ml中含胞磷膽堿鈉10 mg的溶液,加入10 % 1 mol/L氫氧化鈉溶液,置90 ℃水浴加熱3 h,冷卻至室溫,加乙酸調(diào)至中性,得溶液A,作為雜質(zhì)樣品溶液。按2.1項(xiàng)下色譜條件檢測(cè),目標(biāo)雜質(zhì)色譜純度為29.58 %,分析圖譜見(jiàn)圖1。

        圖1 雜質(zhì)樣品溶液的HPLC圖譜

        2.3 目標(biāo)雜質(zhì)的分離制備

        2.3.1 制備柱裝填 取干燥的Sepax HP C18填料(10 μm,120 ?)300 g,置于燒杯中,緩慢加入異丙醇并同向攪拌,保持總體積約800 ml,超聲30 min進(jìn)行勻漿。將勻漿液倒入DAC-50柱管中,調(diào)節(jié)氣閥大小,使氣壓保持0.4 Mpa進(jìn)行制備柱裝填。保壓30 min后,以萘-甲醇溶液(1 mg/ml)2 ml為測(cè)試溶液,流動(dòng)相為無(wú)水乙醇,流速50 ml/min,波長(zhǎng)254 nm,檢測(cè)柱效,若N≥8000,柱效合格,若N<8000,則柱效低,需按以上方法重新裝填至合格。

        2.3.2 一次分離制備 制備液相色譜條件:流動(dòng)相A為0.5 %乙酸,流動(dòng)相B為乙腈,流速50 ml/min,檢測(cè)波長(zhǎng)276 nm,梯度洗脫程序見(jiàn)表1。將2.2項(xiàng)下溶液A注入DAC-50動(dòng)態(tài)軸向壓縮柱制備色譜系統(tǒng),進(jìn)樣體積6 ml,收集目標(biāo)雜質(zhì)峰所對(duì)應(yīng)的洗脫液,一次制備圖譜見(jiàn)圖2。一次制備收集液置40 ℃水浴中減壓旋蒸至約原體積的1/3,得溶液B,作為樣品溶液進(jìn)行二次分離制備。

        表1 一次分離制備梯度洗脫程序

        圖2 一次分離制備圖譜

        2.3.3 二次分離制備 制備液相色譜條件:流動(dòng)相A為水,流動(dòng)相B為乙腈,流速50 ml/min,檢測(cè)波長(zhǎng)276 nm,洗脫程序見(jiàn)表2。將溶液B注入DAC-50動(dòng)態(tài)軸向壓縮柱制備色譜系統(tǒng),進(jìn)樣體積20 ml,收集目標(biāo)雜質(zhì)峰所對(duì)應(yīng)的洗脫液,二次制備圖譜見(jiàn)圖3。二次制備收集液置40 ℃水浴減壓旋蒸至約原體積的1/2,得溶液C,作為待凍干樣品。

        表2 二次分離制備梯度洗脫程序

        圖3 二次分離制備圖譜

        2.3.4 冷凍干燥 將溶液C倒于專用不銹鋼盤中,置于凍干板層,開(kāi)啟真空冷凍干燥機(jī),按表3程序進(jìn)行凍干,凍干結(jié)束氮?dú)饣靥?,氮?dú)獗Wo(hù)出料,最終得到360 mg白色固體粉末。按2.1項(xiàng)下色譜條件檢測(cè),目標(biāo)雜質(zhì)色譜純度為96.34 %,分析圖譜見(jiàn)圖4。

        表3 凍干程序

        圖4 目標(biāo)雜質(zhì)凍干樣品的HPLC圖譜

        2.4 目標(biāo)雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)確證

        2.4.1 紫外-可見(jiàn)吸收光譜(UV-Vis)分析 目標(biāo)雜質(zhì)水溶液在205 nm和262 nm有較強(qiáng)吸收峰,兩處吸收峰分別為雜芳環(huán)E2帶和雜芳環(huán)B帶吸收,提示分子結(jié)構(gòu)中含雜芳環(huán)結(jié)構(gòu)。

        2.4.2 紅外光譜(IR)分析 KBr壓片法結(jié)果顯示分子結(jié)構(gòu)中含羥基、酰胺、甲基、磷酸酯和醚等結(jié)構(gòu)。其中:3411.93 cm-1處的吸收峰為羥基中氧氫鍵的伸縮振動(dòng)特征吸收峰;1701.64 cm-1處的吸收峰為酰胺中碳氧雙鍵的伸縮振動(dòng)特征吸收峰;1474.20 cm-1和1390.46 cm-1處的吸收峰為甲基中碳?xì)滏I的彎曲振動(dòng)吸收峰;1264.86 cm-1和1109.29 cm-1處的吸收峰為磷酸酯中磷氧雙鍵的伸縮振動(dòng)吸收峰;1055.16 cm-1處的吸收峰為醚中碳氧碳單鍵的伸縮振動(dòng)吸收峰;953.59 cm-1處的吸收峰為磷酸酯中磷氧單鍵的伸縮振動(dòng)吸收峰。

        2.4.3 電噴霧離子化質(zhì)譜(ESI-MS)分析 目標(biāo)雜質(zhì)正負(fù)離子模式下的m/z分別為:490.2[M+H]+,488.2[M-H]-。

        2.4.4 核磁共振波譜(NMR)分析1H NMR(400 MHz,DMSO-d6)δ:3.14(s,9H),3.62(m,2H),4.02(m,3H;m,2H),4.32(m,2H),5.64(d,1H),5.79(s,1H),7.79(d,1H),顯示目標(biāo)雜質(zhì)含7組(共計(jì)21個(gè))非活潑氫,從低場(chǎng)到高場(chǎng)積分比例為1:1:1:2:5:2:9,見(jiàn)圖5。13C NMR(100 MHz,DMSO-d6)δ:53.13,59.84,65.18,65.45,69.80,73.12,82.72,87.71,102.08,140.82,150.85,163.20,顯示目標(biāo)雜質(zhì)含14組碳信號(hào),化學(xué)位移53.13 ppm處碳原子因化學(xué)等同發(fā)生信號(hào)重疊,見(jiàn)圖6。HSQC譜圖顯示化學(xué)位移163.20 ppm和150.85 ppm處的碳原子與質(zhì)子無(wú)相互耦合作用,為2組季碳。31P NMR譜圖顯示目標(biāo)雜質(zhì)含2組(共計(jì)2個(gè))磷信號(hào),從低場(chǎng)到高場(chǎng)積分比例為1:1,化學(xué)位移分別為-12.55,-12.68,-13.53,-13.66 ppm。

        圖5 目標(biāo)雜質(zhì)1H NMR圖譜

        圖6 目標(biāo)雜質(zhì)13C NMR圖譜

        綜合以上波譜數(shù)據(jù)及胞磷膽堿鈉結(jié)構(gòu),確定該目標(biāo)雜質(zhì)為尿苷二磷酸膽堿(U D P C,C14H25N3O12P2),其結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖7。

        圖7 UDPC結(jié)構(gòu)

        3 討論

        此前,有人提出,由于胞磷膽堿鈉嘧啶環(huán)上的兩個(gè)氮的孤對(duì)電子都沒(méi)有共軛,在酸性條件下,氮與氫離子結(jié)合后有利于氨基離子(-NH3+)離去,水再作為親核試劑取代,最后異構(gòu)為雜質(zhì)UDPC[2]。實(shí)驗(yàn)證明,堿性條件下,胞磷膽堿鈉也可降解為UDPC,其降解產(chǎn)生機(jī)制見(jiàn)圖8。

        圖8 UDPC產(chǎn)生機(jī)制

        該雜質(zhì)分離制備過(guò)程中,一次分離制備得到的目標(biāo)雜質(zhì)色譜純度約92 %,二次分離制備后其色譜純度達(dá)98 %,樣品冷凍干燥后得到的固體粉末其色譜純度為96.34 %,色譜純度較冷凍干燥前有所降低,表明UDPC易降解,具有不穩(wěn)定性。另外,發(fā)現(xiàn)UDPC固體具有極強(qiáng)的吸濕性,凍干后所得固體顆粒極易吸潮融化,較難得到高純度的固體對(duì)照品。通過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn),最終確定了該雜質(zhì)的分離制備方法及冷凍干燥程序,得到了色譜純度較高的固體對(duì)照品。該分離制備及冷凍干燥過(guò)程整體可控,可為分離制備具有相似性質(zhì)的該類雜質(zhì)對(duì)照品提供方法與思路。

        近年,雜質(zhì)研究成為藥品研發(fā)的重要環(huán)節(jié)。為了更充分地研究藥品中的雜質(zhì),需通過(guò)技術(shù)手段對(duì)藥品中的雜質(zhì)進(jìn)行分離純化,以制得雜質(zhì)對(duì)照品,這通常需要花費(fèi)大量的人力和物力。傳統(tǒng)的制備純化技術(shù)已不能滿足市場(chǎng)需求,需要成本更低、效率更高的替代技術(shù)。高壓制備型液相色譜系統(tǒng)(Prep-HPLC)是一種新型的制備色譜技術(shù),同傳統(tǒng)低壓制備色譜方法相比較,應(yīng)用該方法分離純化的產(chǎn)品在純度、回收率和分離效率等方面具有顯著優(yōu)勢(shì),兼具泵流量大、進(jìn)樣量大及分離時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn),因此在化學(xué)藥物和生物制品的研究及生產(chǎn)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[3-10]。其中,動(dòng)態(tài)軸向壓縮技術(shù)(dynamic axial compression,DAC)是工業(yè)色譜中最常用、最易實(shí)現(xiàn)、效果更為理想的高壓制備液相色譜技術(shù)。DAC系統(tǒng)因其柱效高,重復(fù)性好、分離效率高、制備量大等優(yōu)點(diǎn)而受到越來(lái)越多的關(guān)注[11]。

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