金唯一，李壯壯，吳嘉朔，張方晴，康維鈞，石 鉞*

（1. 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193；2. 河北醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，河北 石家莊 050017）

米邦塔仙人掌（Opuntia milpa alta）原產(chǎn)于墨西哥，1997年引入我國(guó)，現(xiàn)已在我國(guó)廣泛種植并形成一定規(guī)模[1]，2012年國(guó)家將其批準(zhǔn)為普通食品。米邦塔仙人掌葉片含多糖[2-3]、蛋白質(zhì)、氨基酸[4]、有機(jī)酸、礦物質(zhì)及少量黃酮和多酚類成分[5]，具有一定的抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、降糖、神經(jīng)保護(hù)等活性[6-7]。此外有文獻(xiàn)報(bào)道在米邦塔仙人掌中分離鑒定了20余種化合物，多為有機(jī)酸類化合物[8-9]，但目前沒有相關(guān)成分定量分析的報(bào)道。本研究從米邦塔仙人掌中分離鑒定了兩種化合物，分別為5-羥甲基-2-呋喃甲醛和番石榴酸（piscidic acid），其中番石榴酸首次在米邦塔仙人掌中分離得到；并應(yīng)用高效液相色譜（HPLC）建立了同時(shí)檢測(cè)兩種化合物的定量方法，以期為米邦塔仙人掌的開發(fā)和利用提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Kromasil 100A C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱（北京迪馬科技有限公司）；Agilent 1100高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）；Bruker Avance III 600 MHz核磁共振波譜儀[布魯克（北京）科技有限公司]；Ultimate 3000超高效液相色譜儀串聯(lián)Thermo Q-ExactiveTMPlus OrbitrapTM高分辨質(zhì)譜儀（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；UPLC HSS T3 C18（2.1 mm×10 mm，1.8 μm）色譜柱（Waters中國(guó)有限公司）。

1.2 試藥

新鮮米邦塔仙人掌（Opuntia milpa alta），米邦塔仙人掌果購(gòu)自上海金欣仙人掌專業(yè)種植基地；乙腈（色譜純，Honeywell Burdick & Jackson公司）；甲酸[色譜純，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司]；5-羥甲基-2-呋喃甲醛，番石榴酸（自制）。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品提取與分離

取新鮮米邦塔仙人掌葉片和果實(shí)，手工去皮，將葉肉、葉片表皮、果皮分別于60 ℃烘干，打粉，密封后保存在干燥器中，果肉榨汁，經(jīng)8層紗布過濾后，12 000 r/min離心10 min，除去殘?jiān)?，果汁保存?80 ℃ 冰箱中。稱取葉片表皮、葉肉、果皮干燥粉各100 g，按料液比1:10，分別用水、70 %乙醇、50 %乙醇加熱回流提取2次，每次1 h，合并提取液，過濾除去殘?jiān)?，減壓回收溶劑，分別得到400，500，400 mg/ml樣品儲(chǔ)備液。取50 ml葉肉提取液，經(jīng)制備液相色譜，以乙腈-0.1 %甲酸-水進(jìn)行梯度洗脫，得到化合物1（67.1 mg）和2（73.6 mg）。

2.2 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：黃色針晶，C6H6O3，ESI-MSm/z：127.04 [M+H]+。1H NMR（600 MHz，CD3OD）δ：9.53（1H，s，CHO），7.38（1H，d，J=3.6 Hz），6.58（1H，d，J=3.6 Hz），4.57（2H，s，H-α）。13C NMR（150 MHz，CD3OD）δ：179.4（CHO），163.2（C-5），153.9（C-2），124.8（C-3），110.9（C-4），57.6（C-α）。結(jié)合以上光譜數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)報(bào)道[8]，推斷該化合物為5-羥甲基-2-呋喃甲醛。

化合物2：類黃色固體粉末，C11H12O7，HESIMSm/z：255.05 [M-H]-。1H NMR（600 MHz，CD3OD）δ：4.50（1H，S，H-2），2.99（1H，d，J=13.8 Hz，H-4α），3.14（1H，d，J=13.8 Hz，H-4β），7.08（2H，d，J=8.4 Hz，H-2’，6’），6.66（2H，d，J=8.4 Hz，H-3’，5’）。13C NMR（150 MHz，CD3OD）δ：173.3（C-1），74.1（C-2），80.1（C-3），40.6（C-4），174.6（C-5），126.6（C-1’），131.1（C-2’，6’），114.3（C-3’，5’），155.8（C-3’）。結(jié)合以上光譜數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)報(bào)道[10]，推斷該化合物為番石榴酸。

圖1 5-羥甲基-2-呋喃甲醛和番石榴酸結(jié)構(gòu)

2.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取5-羥甲基-2-呋喃甲醛和番石榴酸，用50 %甲醇溶解，配制濃度為10 mg/ml的儲(chǔ)備液，備用。

2.4 供試品溶液的制備

取2.1項(xiàng)下的樣品儲(chǔ)備液，用純凈水稀釋至適宜濃度后，12 000 r/min離心5 min，取上清，果汁離心后，取上清，經(jīng)HPLC分析。

2.5 色譜條件

流動(dòng)相：流動(dòng)相A：乙腈，流動(dòng)相B：0.1 %甲酸水溶液；Kromasil 100A C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；進(jìn)樣體積10 μl；柱溫：30 ℃；梯度洗脫條件為0～25 min，98 %B；25～25.1 min，98 %～95 %B；25.1～35 min，95 %～90 %B；35～35.1 min，90 %～50 %B；35.1～45 min，50 %B；45～50 min，50 %～10 %B；50～60 min，10 %B。流速：1 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：275 nm。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 專屬性 將適宜濃度的對(duì)照樣品溶液和供試樣品溶液分別注入液相色譜儀，按2.5項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。對(duì)照品溶液和供試樣品溶液色譜圖分別見圖2。供試品溶液的色譜圖與對(duì)照品溶液的色譜圖有相同保留時(shí)間的色譜峰，且其他成分無干擾。

圖2 專屬性考察結(jié)果

2.6.2 線性關(guān)系、檢測(cè)限和定量限 取2.3項(xiàng)下對(duì)照品溶液，按2.5項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，進(jìn)行線性回歸，計(jì)算相關(guān)系數(shù)。檢測(cè)限和定量限分別在信噪比為3和10時(shí)測(cè)定，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，5-羥甲基-2-呋喃甲醛在5～150 μg/ml范圍內(nèi)線性范圍良好，R2=0.9992，檢測(cè)限和定量限分別為0.64 μg/ml和2.31 μg/ml；番石榴酸在10～1200 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2=0.9997，檢測(cè)限和定量限分別為1.51 μg/ml和5.05 μg/ml。

表1 米邦塔仙人掌中兩種成分的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢測(cè)限和定量限（n=3）

2.6.3 精密度試驗(yàn) 取60 μg/ml對(duì)照品溶液，按2.5項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定兩種化合物的峰面積，以峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）評(píng)價(jià)精密度，結(jié)果顯示5-羥甲基-2-呋喃甲醛和番石榴酸的峰面積RSD分別為0.90 %和0.45 %，均小于3 %，表明該方法精密度良好。

2.6.4 重復(fù)性試驗(yàn) 按2.4項(xiàng)下方法，各部位分別平行制備6份供試品溶液，按2.5項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以各峰面積RSD評(píng)價(jià)重復(fù)性，結(jié)果顯示5-羥甲基-2-呋喃甲醛和番石榴酸峰面積RSD分別為2.10 %和1.52 %，均小于3 %，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取重復(fù)性樣品1份，分別于0，6，12，24，48，72 h進(jìn)樣分析，測(cè)定各峰面積RSD值，結(jié)果顯示5-羥甲基-2-呋喃甲醛和番石榴酸的峰面積RSD分別為0.26 %和0.17 %，均小于3 %，表明待測(cè)樣品穩(wěn)定性良好。

2.6.6 加樣回收試驗(yàn) 分別取已知含量的樣品，分別加入高、中、低3個(gè)濃度水平的對(duì)照品溶液，每個(gè)水平平行制備3份，按2.5項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算樣品加標(biāo)回收率，結(jié)果見表2、表3，結(jié)果顯示各樣品的加標(biāo)回收率在90 %～110 %之間，RSD均小于3 %，表明該方法準(zhǔn)確度較好。

表2 5-羥甲基-2-呋喃甲醛加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

表3 番石榴酸加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

2.7 樣品分析

將2.4項(xiàng)下適宜濃度的樣品，按2.5項(xiàng)下色譜條件，測(cè)定各樣品中5-羥甲基-2-呋喃甲醛和番石榴酸的含量，平行測(cè)定3份樣品，結(jié)果見表4。

表4 米邦塔仙人掌各部位5-羥甲基-2-呋喃甲醛和番石榴酸的含量（n=3）

3 討論與結(jié)論

本研究對(duì)提取溶劑水、30 %乙醇、50 %乙醇、70 %乙醇和100 %乙醇的提取效果進(jìn)行考察，結(jié)果葉肉粗提物、葉片表皮粗提物和果皮粗提物分別由70 %乙醇、水、50 %乙醇提取，樣品活性較好且待測(cè)成分含量較多。對(duì)超聲提取和加熱回流提取兩種方法進(jìn)行考察，兩種方法提取率相差不大，但考慮到需大量提取樣品，因此選擇加熱回流提取。

分別對(duì)甲醇-水、乙腈-0.1 %甲酸水、甲醇-0.1 %甲酸水3個(gè)系統(tǒng)流動(dòng)相進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用乙腈-0.1 %甲酸水作為流動(dòng)相時(shí)，各峰分離度較好，基線平穩(wěn)，因此采用乙腈-0.1 %甲酸水作為系統(tǒng)流動(dòng)相。對(duì)兩種定量成分對(duì)照品溶液分別進(jìn)行UV全波長(zhǎng)（190～400 nm）掃描，發(fā)現(xiàn)5-羥甲基-2-呋喃甲醛在280 nm處有最大吸收，番石榴酸在220 nm和275 nm處有兩個(gè)吸收峰，其在220 nm處有最大吸收，但考慮到本實(shí)驗(yàn)所測(cè)樣品番石榴酸含量高于5-羥甲基-2-呋喃甲醛，且在275 nm處各峰的分離度較好，基線平穩(wěn)，因此本實(shí)驗(yàn)選擇275 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

綜上，本實(shí)驗(yàn)通過半制備液相色譜儀，分離純化了兩種化合物，分別為5-羥甲基-2-呋喃甲醛和番石榴酸，番石榴酸首次在米邦塔仙人掌中被鑒定。本研究采用HPLC同時(shí)測(cè)定米邦塔仙人掌中5-羥甲基-2-呋喃甲醛和番石榴酸含量，方法穩(wěn)定可靠，方法學(xué)考察結(jié)果表明精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和準(zhǔn)確度均符合要求，能準(zhǔn)確測(cè)定米邦塔仙人掌中5-羥甲基-2-呋喃甲醛和番石榴酸的含量，可為米邦塔仙人掌的開發(fā)利用和質(zhì)量控制提供依據(jù)。