張揚(yáng) 白菊 張王剛 何愛(ài)麗

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院血液科，陜西 西安 710004)

原發(fā)免疫性血小板減少癥(primary immune thrombocytopenia ，ITP)是一組獲得性免疫介導(dǎo)的單獨(dú)血小板過(guò)度破壞所致的出血性疾病[1]。ITP的一線治療方案為糖皮質(zhì)激素(潑尼松或地塞米松)，有效率為70%～80%，長(zhǎng)期有效率為30%～50%，治療的預(yù)期效果很大程度上取決于糖皮質(zhì)激素敏感與否，目前還缺乏統(tǒng)一的定義和評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)；經(jīng)驗(yàn)是足量治療3～4周，如果潑尼松標(biāo)準(zhǔn)劑量治療4周無(wú)效則定義為糖皮質(zhì)激素抵抗[2]。目前實(shí)驗(yàn)室尚無(wú)特異性的指標(biāo)及分子標(biāo)志物來(lái)早期區(qū)分是否激素治療有效，4周的激素治療對(duì)激素抵抗患者并不能獲益，延誤治療時(shí)機(jī)的同時(shí)還要承受著激素相關(guān)的副作用，如感染、高血壓、高血糖、潰瘍、股骨頭壞死、肥胖等等。ITP患者糖皮質(zhì)激素抵抗的機(jī)制復(fù)雜且與多種因素相關(guān)，但目前只是從某一角度著手進(jìn)行的研究[3-5]。抵抗機(jī)制不僅是基因水平的改變，也涉及到蛋白質(zhì)層次的，特別是蛋白質(zhì)信號(hào)分子的改變，因此，從蛋白水平和整體角度研究尋找糖皮質(zhì)激素抵抗與糖皮質(zhì)激素敏感的差異蛋白是可能的[6-7]。不同功能表面的磁珠蛋白分離聯(lián)合基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(Matrix assisted laser desorption/ionization time of flight laths spectrometer，MALDI-TOF-MS)及Cliprotools所組成的CLIPROT系統(tǒng)是集分離、純化、檢測(cè)和分析于一體的全新富有特色的蛋白組學(xué)技術(shù)，在實(shí)體瘤和耐藥機(jī)制研究中廣為應(yīng)用[8-11]。本實(shí)驗(yàn)中我們通過(guò)該技術(shù)對(duì)ITP患者血清樣本中不同蛋白質(zhì)標(biāo)志物分離純化，進(jìn)一步應(yīng)用質(zhì)譜技術(shù)分析獲取血清蛋白質(zhì)表達(dá)譜，以尋找差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，以期為臨床早期判斷ITP患者糖皮質(zhì)激素治療有效與否提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集 2016年3月～2017年3月西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院住院患者共 60 例 ITP 血清樣品，收集初入院未使用任何藥物時(shí)的外周血血清。所有患者均符合國(guó)內(nèi) ITP 的診斷標(biāo)準(zhǔn)[12]，隨訪4周，按臨床診療效果分組：①糖皮質(zhì)激素敏感組：完整激素治療4周后(潑尼松1 mg/kg，療效穩(wěn)定后逐漸減量) PLT≥30×109/L且大于基線水平2倍，共32例，其中男性14例，女性18例，中位年齡44.5(18～75)歲。②糖皮質(zhì)激素抵抗組：完整激素治療4周后，PLT<30×109/L或不足基線2倍或者有活動(dòng)性出血，共28例，其中男性10例，女性18例，中位年齡37.5(19～70)歲。

1.2 標(biāo)本的采集和處理 采集患者空腹時(shí)外周血3 mL，置于無(wú)抗凝劑的干燥管中，室溫靜置1 h，離心機(jī)室溫離心10 min(600g)，離心結(jié)束后吸取血清部分，0.5 mL/管分裝3管，-80℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試劑與儀器 基質(zhì)、無(wú)水乙醇、丙酮、弱陽(yáng)離子交換磁珠試劑盒均購(gòu)自美國(guó)布魯克·道爾頓公司。200 μL的Orcugen樣品管購(gòu)自西安博精生物技術(shù)有限公司。CLINPROT系統(tǒng)為美國(guó)布魯克·道爾頓公司產(chǎn)品，包括磁珠分離器、基質(zhì)輔助激光解吸離子飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(MALDI-TOF-MS,Microflex)、Anchorchip靶、Clinprotools2.2、FlexControl2.2采集軟件、分析軟件Flexanalysis3.0。母液配置：基質(zhì)α-氰基-4-羥基肉桂酸(a-Cyano-4-hydroxycinna- mic acid,HCCA)1.2～1.4 mg，加入1～1.2 mL丙酮稀釋制成1.2 mg/μL的HCCA母液。母液可在-20℃保存2 d。無(wú)水乙醇(1∶2)混合均勻即得0.4 mg/mL HCCA的基質(zhì)溶液，基質(zhì)溶液當(dāng)天配置當(dāng)天使用。

1.4 樣本的制備 室溫下溶解凍存的外周血清標(biāo)本。

1.4.1 運(yùn)用弱陽(yáng)離子交換磁珠結(jié)合血清蛋白 將磁珠試劑盒自4℃冰箱取出，手動(dòng)上下?lián)u動(dòng)完全混勻其中的弱陽(yáng)離子磁珠懸浮液1 min，取10 μL 磁珠結(jié)合緩沖液(BB)加入200 μL Orcugen樣品管中，再加入10 μL 磁珠至樣品管，用加樣槍吸打混勻，避免起泡；然后向Orcugen樣品管中加5 μL血清，用加樣槍吸打至少5 次使其混勻，避免起泡；室溫靜置5 min；將Orcugen樣品管放入磁珠分離器。完全混勻磁珠試劑盒中的弱陽(yáng)離子磁珠懸浮液，在200 μL Orcugen管中加入10 μL磁珠結(jié)合緩沖液和10 μL磁珠，混勻后再加入5 μL血清標(biāo)本，混勻，室溫靜置5 min后放入磁珠分離器，貼壁1 min，吸去懸浮的液體后加入100 μL磁珠清洗緩沖液，靜置，磁珠與液體分離后吸去懸浮的液體，完全吸干凈懸浮的液體后取下樣品管，加入5 μL磁珠洗脫緩沖液，混勻磁珠，放入磁珠分離器，貼壁2 min，將上清移至已加入5 μL穩(wěn)定緩沖液的0.5 mL樣品管，混勻。

1.4.2 Microflex MALDI-TOF質(zhì)譜分析 Anchorchip靶板上點(diǎn)1 μL洗脫樣品，室溫干后，點(diǎn)1 μL基質(zhì)(已提前制備)，室溫干，靶板放入Microflex質(zhì)譜儀中，標(biāo)準(zhǔn)品校正后檢測(cè)樣本，使用FlexControl 2.2軟件采集數(shù)據(jù)，收集范圍700～10000 Da，獲得不同質(zhì)荷比(mass charge ratio，m/z)的蛋白峰構(gòu)成的質(zhì)譜圖。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用ClinProTools軟件分析數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用軟件自帶的統(tǒng)計(jì)學(xué)算法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 應(yīng)用Clinprot系統(tǒng)模擬分析激素敏感組和激素抵抗組激素治療前的血清指紋圖 將采集軟件采集到的血清圖譜經(jīng)基線消減、校正和歸一后導(dǎo)入分析軟件，激素抵抗組和激素敏感組激素使用前血清的質(zhì)譜結(jié)果分析結(jié)果，見(jiàn)圖1。通過(guò)ClinProtools2.2軟件對(duì)兩組血清樣品的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比分析，在分子量700～10000 Da的范圍內(nèi)共得到41個(gè)差異蛋白質(zhì)表達(dá)峰，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

圖1 應(yīng)用Clinprotools 2.2軟件模擬和分析激素抵抗組和激素敏感組激素使用前血清蛋白質(zhì)指紋圖譜

2.2 應(yīng)用Clinprot系統(tǒng)模擬分析激素敏感組激素使用前后血清指紋圖 將采集軟件采集到的血清圖譜經(jīng)基線消減、校正和歸一后導(dǎo)入分析軟件，對(duì)激素敏感組激素使用后和激素敏感組激素使用前血清的質(zhì)譜結(jié)果分析，見(jiàn)圖2。通過(guò)ClinProtools 2.2軟件對(duì)這兩組血清樣品的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比分析，在分子量700～10000Da范圍內(nèi)共得到55個(gè)差異蛋白質(zhì)表達(dá)峰，其中5個(gè)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異蛋白質(zhì)峰(P<0.05)，激素使用后表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì)有4個(gè)，下調(diào)的有1個(gè)(表1)。

圖2 應(yīng)用Clinprotools 2.2軟件模擬和分析激素敏感組激素使用前后血清蛋白質(zhì)指紋圖譜

表1 激素敏感組激素使用前后差異表達(dá)蛋白質(zhì)

2.3 應(yīng)用Clinprot系統(tǒng)模擬分析激素抵抗組激素使用前后血清指紋圖 將采集軟件采集到的血清圖譜經(jīng)基線消減、校正和歸一后導(dǎo)入分析軟件，對(duì)激素抵抗組激素使用前后血清的質(zhì)譜結(jié)果(圖3)。通過(guò)ClinProtools 2.2軟件對(duì)這兩組血清樣品的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比分析，在分子量700～10000 Da范圍內(nèi)共得到56個(gè)差異蛋白質(zhì)表達(dá)峰，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

圖3 應(yīng)用Clinprotools 2.2軟件模擬和分析激素抵抗組激素激素使用前后血清蛋白質(zhì)指紋圖譜

3 討論

除了運(yùn)用在腫瘤的早期診斷中外，蛋白組學(xué)方法也廣泛地應(yīng)用于耐藥研究中；幾乎所有的病理生理過(guò)程中，藥物和環(huán)境因子的作用都依賴于蛋白質(zhì)，并引起相應(yīng)蛋白質(zhì)的變化，同時(shí)蛋白質(zhì)組的變化也能提供該過(guò)程變化的信息[13-15]。在疾病出現(xiàn)明顯的癥狀前都會(huì)有一些蛋白質(zhì)發(fā)生變化，尋找這些與疾病相關(guān)的蛋白，對(duì)發(fā)病機(jī)制的闡明，建立診斷模型，研究疾病的耐藥機(jī)制具有重要意義。Feng等[16]通過(guò)蛋白組學(xué)的方法研究甲氨蝶呤的耐藥發(fā)現(xiàn)二氫葉酸脫氫酶(DHFR) 在甲氨蝶呤的耐藥中起很大作用。Woronieck等[17]通過(guò)蛋白組學(xué)方法發(fā)現(xiàn)，4144 Da的分子是區(qū)分兒童腎病綜合征糖皮質(zhì)激素抵抗與糖皮質(zhì)激素敏感的最有意義的蛋白質(zhì)分子。黃艷軍等[18]通過(guò)2-D凝膠電泳聯(lián)合MALDI-TOF-MS的方法發(fā)現(xiàn)了兒童微小病變型腎病綜合征患者激素敏感與抵抗相關(guān)的12個(gè)差異蛋白，與激素敏感蛋白圖譜比較，在激素耐藥蛋白圖譜上蛋白酶抑制劑、α1B糖蛋白、IRAK4 表達(dá)下調(diào)，其余9 種蛋白表達(dá)上調(diào)。潘艷艷等[13]在MALDI-TOF-MS方法及雙向電泳發(fā)現(xiàn)，腎病綜合征中的激素耐藥組和激素敏感組的兒童尿液中具有12個(gè)差異表達(dá)的蛋白存在，其中包括尿液中α1-抗胰蛋白酶和轉(zhuǎn)鐵蛋白。本研究治療前激素抵抗和激素敏感患者血清蛋白指紋對(duì)比未得到具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異蛋白，考慮可能與樣本量不足相關(guān)，或者是差異蛋白的分子量不在700～10000 Da范圍內(nèi)。

激素敏感患者激素治療前后的血清蛋白指紋圖譜相比較，在激素敏感組激素使用后表達(dá)上調(diào)的蛋白質(zhì)有4個(gè)，分子量分別為9289.84、4644.96、7764.95和4964.12 Da，下調(diào)的有1個(gè)，分子量為6666.94 Da。激素抵抗患者激素治療前后的血清蛋白指紋圖譜相比較，未得到具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的蛋白。由此可以推測(cè)，激素的效應(yīng)最終可能作用于血清中，引起了血清中蛋白的變化，使得血小板數(shù)值最終升高。

將激素敏感前后比較得到的差異蛋白峰與我們前期實(shí)驗(yàn)中ITP和健康對(duì)照比較得到的差異蛋白峰相比較，發(fā)現(xiàn)其存在極為相似的分子量，激素敏感組前后比較得到的蛋白相對(duì)分子量4644.96 Da，峰均值在激素使用前后分別為1.05和2.4，使用后較前上調(diào)，ITP標(biāo)志蛋白中也存在分子量為4644.92 Da的蛋白，峰均值在ITP組和健康對(duì)照中分別為1.17和2.18[19]，若推測(cè)這2個(gè)蛋白為同一蛋白，則此蛋白在ITP患者中較正常者下調(diào)，但經(jīng)過(guò)激素治療后上調(diào)至接近正常者水平，則可認(rèn)為其與ITP的發(fā)病和激素的作用密切相關(guān)。同理，還有相對(duì)分子量7764.95和7764.78 Da，4964.12和4964.36 Da，均在ITP患者中表達(dá)較正常下調(diào)，經(jīng)過(guò)激素治療后上調(diào)至接近正常者水平。其中7764.95 Da，與血小板第4因子(PF4)7800 Da極為接近，因一個(gè)氨基酸的相對(duì)分子量為75～220 Da之間，推測(cè)此蛋白是PF4因子，PF4由激活的血小板分泌，在巨核細(xì)胞中合成的貯存于a-顆粒中的大分子蛋白聚糖,具有中和肝素,炎癥趨化,抑制血管形成和巨核細(xì)胞生長(zhǎng)的功能[20-21]。細(xì)胞因子是參與骨髓造血的重要的調(diào)控因子，有研究認(rèn)為PF4是巨核細(xì)胞和血小板生成的調(diào)控因子，與巨核細(xì)胞的增殖、成熟和分化密切相關(guān)，但具體的調(diào)控機(jī)制還不清楚[22-25]。這3個(gè)蛋白與ITP的發(fā)病和糖皮質(zhì)激素的作用可能相關(guān)，有待加大樣本量，對(duì)其進(jìn)行驗(yàn)證以及純化，進(jìn)一步鑒定并分析其功能，對(duì)ITP的發(fā)病機(jī)制和糖皮質(zhì)激素的作用機(jī)制有著重要意義。

4 結(jié)論

激素敏感者治療前后存在5個(gè)差異表達(dá)的蛋白，可能與ITP的激素治療效果密切相關(guān)。