楊海霞 張鵬 陸倫 鄧秀英 陳艷梅

(遂寧市中心醫(yī)院藥學部，四川 遂寧 629000)

在細胞活性與生長的檢測中，噻唑藍(MTT)比色法的應用頻率相對較高，檢測原理主要體現(xiàn)在活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為藍紫色結(jié)晶甲臜并沉積于細胞[1]，而在正常狀況下，死細胞是無這項功能的。膀胱癌多發(fā)生于膀胱黏膜上，是目前臨床醫(yī)學中相對常見、多發(fā)的惡性腫瘤之一[2]，治療方法包括手術(shù)切除、放療、化療等。近年來的相關(guān)研究數(shù)據(jù)表明，作為一種植物蛋白，MAP30(Momoridica anti-HIV protein of 30KD，MAP30)主要從苦瓜種子中提取，實驗證實其有多種生物學活性，可參與抗病毒、抗腫瘤、抗菌等[3]，但由于MAP30屬大分子藥物，能有效進入細胞的幾率較低，而提高其進入細胞的效率對抗腫瘤應用無疑具有十分突出的作用。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸過程中均扮演著重要的作用。最新研究發(fā)現(xiàn)[4]，肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1(metastasis related transcription factor 1，MALAT1)、lncRNA HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA(Long-chain non coding RNA Hox transcription antisense RNA,HOTAIR)及膀胱尿路上皮癌相關(guān)1(Urothelial carcinomaassociated 1，UCA1)在膀胱癌中均呈高表達，這提示上述三種物質(zhì)可能是包括膀胱癌在內(nèi)的惡性腫瘤的生物學標志物之一。苦瓜MAP30蛋白，對人體中的多種腫瘤細胞均有較好的抑制作用，并可促進其凋亡[5]，但與膀胱癌相關(guān)的研究卻相對較少。因此，本文將在MTT法檢測苦瓜MAP30蛋白的基礎(chǔ)上探討苦瓜MAP30蛋白與膀胱癌5637細胞增殖的關(guān)系及對MALAT1、HOTAIR及UCA1表達水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 細胞系：膀胱癌5637細胞系(實驗樣表)均購自中國科學院上海細胞所，而苦瓜則購自本院就近區(qū)域的蔬菜批發(fā)市場(均屬新鮮稚嫩苦瓜)，約500 g。實驗菌株：pET-28質(zhì)粒載體、DH5α克隆菌株及BL21(DE3)表達菌株均為本院自存。試劑：改良型RPMI Medium1640培養(yǎng)基(Gibico公司)，RIPA裂解液(碧云天公司)、DNA凝膠回收試劑盒(捷瑞生物工程有限公司)、質(zhì)粒小量制備試劑盒(捷瑞生物工程有限公司)、異丙基硫代半乳糖苷(IPTG，Genebase公司)、4%多聚甲醛(上海世澤生物科技有限公司)、MTT(上海世澤生物科技有限公司)。實驗儀器：熒光酶標儀(賽默飛公司)、80-2B臺式及TGL-16C離心機(上海離心機研究所)、ECP3000電泳儀(北京六一儀器廠)、超低溫冰箱(日本三洋公司)、BB5060 CO2培養(yǎng)箱(賽默飛公司)、PCR儀(賽默飛公司)、微孔濾膜(0.22 μm，Bio-Rad公司)、流式細胞儀(Bio-Rad公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 苦瓜MAP30基因的克隆、表達及純化 克隆：在成功構(gòu)建并保存重組質(zhì)粒EGFP-pET28a及EGFP-HBD-pET28b質(zhì)粒的基礎(chǔ)上將其轉(zhuǎn)化成大腸桿菌感受態(tài)細胞BL21菌株后置于培養(yǎng)基中培養(yǎng)(溫度：37℃，培養(yǎng)時間：60 min)，然后構(gòu)建MAP30重組表達載體(帶有信號肽的載體：MAP30s-pET28a、MAP30s-HBD-pET28a)，然后以苦瓜果肉基因組DNA為模板進行苦瓜MAP30擴增物序列(表1)進行聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction，PCR)擴增處理并電泳(瓊脂糖凝膠電泳儀)后進行PCR產(chǎn)物回收，然后將其連接于pMD-19T simple載體上，接著再次進行菌落PCR驗證，并在4℃條件下連接過夜。采用限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶將擴增片段克隆至pET-28質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞進行擴增，用質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒，酶切體系進行鑒定。融合蛋白表達：將上述構(gòu)建完成的重組質(zhì)粒表達型感受態(tài)細胞(DE3)進行轉(zhuǎn)化處理并提取其單菌落接種(卡那霉素：50 μg/mL)于LB培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)(溫度：37℃，培養(yǎng)時間：16 h)后加入異丙基硫代半乳糖苷(Isopropylthiogalactoside，IPTG)進行誘導表達，離心(離心速率：3000 r/min，離心時間：0.5 h)處理，收集上清及包涵體后進行SDS-PAGE蛋白電泳分析，最后進行純化。純化：用超純水清洗介質(zhì)后進行平衡Ni-NTA層析柱處理，并使其pH穩(wěn)定，待上樣完成后用緩沖液A清洗柱體以去除雜蛋白并確保獲取無雜質(zhì)的目的蛋白；然后用超純水清洗介質(zhì)至中性后加入20%乙醇保存，4℃保存，接著收集蛋白樣品后置于透析液中透析4次，用BCA試劑盒測定蛋白濃度，并用無菌PCR管分裝和置于超低溫冰箱(-80℃)中保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 苦瓜MAP30擴增引物序列

1.2.2 5637細胞培養(yǎng) 將凍存的膀胱癌5637細胞取出并快速水浴(42℃)而使其解凍，接著將細胞懸液轉(zhuǎn)入10 mL無菌離心管中離心(離心速率：1000 r/min，離心時間：6 min)處理后去上清并預熱處理后轉(zhuǎn)入細胞瓶中CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 d至細胞貼壁。加入含小牛血清RPMI 1640培養(yǎng)液復蘇培養(yǎng)，待細胞長滿后用胰蛋白酶消化，吸管反復吹打至形成單個細胞懸液后進行傳代培養(yǎng)或置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 MAP30蛋白對5637細胞增殖影響的檢測 按MTT實驗檢測相關(guān)步驟操作，將對數(shù)生長期的細胞消化懸液后置入96孔板中并進行過夜(溫度37℃，5%CO2細胞培養(yǎng)箱)，培養(yǎng)至貼壁。37℃孵育24 h后去培養(yǎng)箱并加入細胞培養(yǎng)液(MTT溶液20 mL和180 mL無血清)，鋪板使細胞調(diào)密度至2×103/孔，再次孵育(CO2細胞培養(yǎng)箱，時間4 h)處理后棄孔內(nèi)培養(yǎng)基并加入二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解150 μL(甲瓚)后置于搖床上振蕩10 min，最后讀取其OD490吸光值。抑制率計算公式：細胞生長抑制率=(1-處理組平均OD值/對照組平均OD值)×100%。

1.2.4 MAP30蛋白對5637細胞凋亡的影響檢測 將5637細胞接種于96孔板中培養(yǎng)，接著加入不同濃度(0、100、200、400 μg/mL)的MAP30蛋白溶液，以上4種濃度的MAP30溶液各重復5孔，培養(yǎng)時間分別24、48 h。上述實驗重復3次。按凋亡檢測試劑盒說明書要求檢測細胞凋亡率。

1.2.5 MAP30蛋白對lncRNA表達的影響檢測 培養(yǎng)5637細胞(24、48 h)并提取(TRIzol試劑)其總RNA。接著將總DNA合成cDNA(Reagents試劑盒逆轉(zhuǎn)錄)并檢測(檢測方法：RT-PCR)lncRNA MALAT-1、HOTAIR、UCA1相對表達(RQ)值，RQ=2-△Ct，△Ct=Ct目標-Ct內(nèi)參。引物序列見表2。

表2 RT-PCR檢測時所用引物序列

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學分析，不同濃度的MAP30蛋白與5637細胞增殖的抑制與凋亡效能等計數(shù)資料用2檢驗。苦瓜MAP30蛋白對膀胱癌5637細胞lncRNA表達等計量資料用t檢驗，以表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的MAP30蛋白與膀胱癌5637細胞的抑制與凋亡效能比較 抑制率：膀胱癌5637細胞增殖時所產(chǎn)生的抑制率越高時，MAP30蛋白的濃度也越高，且時間越長，即MAP30蛋白濃度與膀胱癌5637細胞增殖呈正比(P<0.05)。凋亡率：膀胱癌5637細胞凋亡隨MAP30濃度遞增而逐漸上升，且MAP30濃度(培養(yǎng)48h)為400μg/mL時，膀胱癌5637細胞凋亡率達到最高，MAP30濃度與膀胱癌5637細胞凋亡呈正比(P<0.05)，見圖1～3。

圖1 不同濃度MAP30蛋白對5637細胞凋亡相關(guān)流式圖

圖2 不同濃度的MAP30蛋白與膀胱癌5637細胞的抑制效能

圖3 不同濃度的MAP30蛋白與膀胱癌5637細胞凋亡的影響

2.2 苦瓜MAP30蛋白對膀胱癌5637細胞lncRNA表達的相關(guān)性 膀胱癌5637細胞lncRNA MALAT-1、HOTAIR、UCA1表達水平隨苦瓜MAP30蛋白濃度的遞增而逐漸降低，檢測時間為48 h且苦瓜MAP30蛋白濃度為400 μg/mL時上述三項指標的表達水平均顯著低于檢測24、48 h時的其他苦瓜MAP30蛋白濃度(P<0.05)，見圖4～6。

圖4 苦瓜MAP30蛋白對膀胱癌5637細胞lncRNA MALAT-1表達的影響

圖5 苦瓜MAP30蛋白對膀胱癌5637細胞lncRNA HOTAIR表達的影響

圖6 苦瓜MAP30蛋白對膀胱癌5637細胞lncRNA UCA1表達的影響

3 討論

近年來的研究表明，以微小RNA(Micro RNA，miR)為典型的非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNAs)在各種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸中具有重要作用[6]。有研究表明，膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸及預后均與miR-1、miR-499和miR-208的針對性調(diào)控相關(guān)[7]。苦瓜MAP30蛋白是常見的真核基因之一，生物活性良好，作為一種Ⅰ型核糖體失活蛋白，不僅抗病毒、抗菌、抗腫瘤活性較強，且在誘導腫瘤細胞凋亡也有較好的特異性，且對未感染的正常二倍體細胞也幾乎無毒性，耐藥性極低[8-11]。研究認為，MAP30蛋白對肝癌、骨髓癌、乳腺癌等惡性腫瘤及黑色素癌、大腸癌、食管癌等的腫瘤細胞的增殖及凋亡均有較好的抑制和誘導作用[12-13]，但MAP30蛋白與膀胱癌是否存在相關(guān)性的研究數(shù)據(jù)卻鮮有報道。

相關(guān)研究證實，腫瘤細胞的凋亡顯然受lncRNA的調(diào)控[14-15]，MALAT-1表達與腫瘤嚴重程度呈正相關(guān)，可能通過增加HMGB1蛋白表達，促進凋亡基因自噬，從而抑制細胞凋亡[16]。HOTAIR可增加自噬在機體損傷中的機制，而MiR-20b-5p又可通過靶向ATG7抑制細胞自噬，而HOTAIR又可將MiR-20b-5p調(diào)控為內(nèi)源性海綿，這又無疑提升了ATG7的表達水平[17]。UCA1作為一種新型的調(diào)控因子，在各種癌癥的發(fā)生、發(fā)展過程中均發(fā)揮著重要作用，其水平表達與病理分級、臨床分期和復發(fā)關(guān)系等密切相關(guān)[18-19]。研究發(fā)現(xiàn)，UCA1mRNA表達在膀胱癌組織中的陽性表達率明顯高于正常膀胱組織[20]，提示，下調(diào)UCA1對促進膀胱癌組織中的腫瘤細胞的凋亡和抑制5637細胞的增殖均有極大幫助。

本研究結(jié)果表明，苦瓜MAP30蛋白對膀胱癌5637細胞增殖的抑制和凋亡誘導方面均有較好的效果。提示膀胱癌5637細胞的增殖與凋亡同樣受苦瓜MAP30蛋白的調(diào)控。其機制可能如下：①作為一種常見的核糖體失活蛋白，苦瓜MAP30蛋白可通過抑制膀胱癌患者的腫瘤細胞中的核糖體活性而起到抑制細胞蛋白合成之目的，最終對腫瘤的生長、惡化及細胞凋亡其抑制與誘導。②苦瓜MAP30蛋白的抗癌作用可通過上調(diào)機體中的黏附分子CD34表達，繼而改變腫瘤細胞的粘附性。③苦瓜MAP30蛋白具有抗病毒和抗菌作用。④苦瓜MAP30蛋白可對ERK1、AKT活化進行抑制，從而促進NF-kB通路活性被抑制，這同樣有利于膀胱癌腫瘤細胞的凋亡。除此之外，近年來的研究也證實，苦瓜MAP30蛋白在惡性腫瘤中的機制還包括降低線粒體膜電位而促進細胞色素C的釋放，影響突變型p53基因表達及上調(diào)凋亡前期蛋白Bax和下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的轉(zhuǎn)錄和表達等[21]，但這些機制仍需進一步研究提供佐證。

本研究表明，膀胱癌5637細胞lncRNA MALAT-1、HOTAIR、UCA1表達水平隨苦瓜MAP30蛋白濃度的遞增而逐漸降低，檢測48 h且苦瓜MAP30蛋白濃度為400 μg/mL時，膀胱癌5637細胞lncRNA 中的MALAT-1、HOTAIR、UCA1表達水平均顯著低于檢測24、48 h時的其他苦瓜MAP30蛋白濃度(P<0.05)，提示上述三項指標均受苦瓜MAP30蛋白的調(diào)控。同時隨著MAP30蛋白作用濃度提高，5637細胞MALAT-1、HOTAIR和UCA1等的lncRNA表達均隨著苦瓜MAP30蛋白濃度的增高而逐漸下降，提示MAP30可能通過抑制MALAT-1、HOTAIR和UCA1的增殖和誘導其凋亡。

4 結(jié)論

苦瓜MAP30蛋白對膀胱癌5637細胞增殖的抑制和凋亡誘導方面有較好的效果，且可下調(diào)MALAT-1、HOTAIR、UCA1表達水平。