馬 陳 廖 奕 沈 霖 盧芙蓉 帥 波

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，武漢 430022

益氣活血方是沈霖教授治療出血性血小板病的經(jīng)驗方，經(jīng)20余年臨床驗證，該方在控制臨床出血癥狀、糾正血小板聚集缺陷及降低停藥1年后復(fù)發(fā)率等方面均明顯優(yōu)于常規(guī)西藥腎上腺色腙片[1]。近期臨床藥物試驗[2-3]提示，調(diào)控非活性的菱形蛋白2(inactive rhomboid-like protein 2，iRhom2)及血小板膜糖蛋白Ⅴ(platelet membrane glycoprotein V，GP Ⅴ)的表達(dá)可能是益氣活血方治療出血性血小板病作用靶點之一。為了進(jìn)一步研究益氣活血方組方藥物的具體作用靶點以及作用機制，本研究通過人血標(biāo)本體外加藥的方法，觀察了全方、配伍組和單味藥組對出血性血小板病患者靜脈血中iRhom2及GP Ⅴ表達(dá)的影響，旨在探討益氣活血方治療出血性血小板病的作用機制及益氣活血中藥配伍的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年10月—2021年3月就診于本院中西醫(yī)結(jié)合科門診的33例出血性血小板病患者作為研究組，其中男9例，女24例；年齡(34.51±14.27)歲，年齡范圍為20～57歲；病程(7.18±5.26)年，病程范圍為2～13年。另選30例血小板聚集檢測無異常發(fā)現(xiàn)的健康獻(xiàn)血員作為正常對照組，其中男10例，女20例；年齡(33.27±8.26)歲，年齡范圍為21～55歲。2組患者性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

研究組患者符合文獻(xiàn)[4]中出血性血小板病相關(guān)的診斷標(biāo)準(zhǔn)：患者有多部位出血臨床表現(xiàn)；按常規(guī)操作檢測患者血小板聚集最大聚集率，其中最大聚集率在21%～40%者為反應(yīng)不良，低于20%者為反應(yīng)缺如，患者對1項或多項誘聚劑誘導(dǎo)的聚集反應(yīng)不良或缺如。

1.3 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)；在本研究前2周內(nèi)，未服用阿司匹林、潘生丁、肝素以及活血化瘀類中藥等可能影響血小板功能的藥物；同意參與本項研究并簽署知情同意書。

排除標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)內(nèi)科、血管外科、耳鼻喉科、婦科、口腔科和眼科等科室診視，發(fā)現(xiàn)診斷性出血病灶；合并其他臟器重大疾病且預(yù)后不佳者；精神類疾病或智力、語言障礙者；不愿意簽署知情同意書者。

1.4 體外干預(yù)方法

1.4.1 血液標(biāo)本的制備 采用真空采血管(美國BD公司)采集所有受試對象清晨空腹肘靜脈血，以3.8%枸櫞酸鈉進(jìn)行抗凝處理，血液與抗凝劑的比例為9：1。出血性血小板病患者靜脈血經(jīng)抗凝處理后分為12等份，每份0.75 mL血液標(biāo)本；健康獻(xiàn)血員靜脈血經(jīng)抗凝處理后取1份0.75 mL血液標(biāo)本。

1.4.2 中藥拆方及分組 ①全方組：黃芪10 g、黨參10 g、當(dāng)歸10 g、白芍5 g、桃仁5 g、甘草2 g；②益氣活血組(全方去甘草)：黃芪10 g、黨參10 g、當(dāng)歸10 g、白芍5 g、桃仁5 g；③黃芪當(dāng)歸組：黃芪10 g、當(dāng)歸10 g；④益氣組：黃芪10 g、黨參10 g；⑤活血組：當(dāng)歸10 g、白芍5 g、桃仁5 g；⑥黃芪組：黃芪10 g；⑦黨參組：黨參10 g；⑧當(dāng)歸組：當(dāng)歸10 g；⑨白芍組：白芍5 g；⑩桃仁組：桃仁5 g；甘草組：甘草2 g。中藥飲片均由本院中藥房提供。

1.4.3 藥物的制備 參照文獻(xiàn)[5]，中藥用200 mL清水浸泡12 h，武火煮沸，文火煮0.5 h；取出藥液后，再加入200 mL清水，武火煮沸，文火煮0.5 h，取藥液；將2次藥液合并，濃縮至較高濃度。按體積比2：3加入無水乙醇，4 ℃靜置24 h，用無菌濾紙濾去殘渣；再用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)至無醇味，并進(jìn)一步將各組藥液濃縮至10 mL，調(diào)整pH值為6.8～8.5，均勻倒入培養(yǎng)皿置于-20 ℃預(yù)凍；然后冷凍真空干燥，得到粉末狀物質(zhì)，放入干燥器中備用。根據(jù)既往體外實驗[6-7]結(jié)果，全方組終濃度為4.2 mg/mL時對血小板聚集功能及GP Ib α影響最為顯著，所以各實驗組中藥凍干粉臨用前均稀釋為4.2 mg/mL濃度，經(jīng)過0.22 μm的濾膜過濾除菌后，與血液標(biāo)本共孵育。

1.4.4 中藥干預(yù)靜脈血標(biāo)本 益氣活血方全方及拆方組是在出血性血小板病患者血液標(biāo)本中分別加入10 μL相對應(yīng)的中藥提取物；陰性對照組是在出血性血小板病患者血液標(biāo)本中加入10 μL的0.9%NaCl注射液；正常對照組是在健康獻(xiàn)血員血液標(biāo)本中加入10 μL的0.9%NaCl注射液。將給藥后血液標(biāo)本在37 ℃下孵育30 min。

1.5 觀察指標(biāo)

Real-time PCR法檢測iRhom2 mRNA表達(dá)：按照YBR Green PCR(KAPA Biosystems，貨號KM4101)試劑盒說明書，通過QIAzol Lysis Reagent和氯仿提取總RNA，測定RNA濃度。使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TAKARA，貨號639505)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。引物名稱及序列如下，iRhom2-F CAAGATGCCCAAGATT，iRhom2-R GGAGTAGCCAGAACGG，在Real-Time System熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad)上進(jìn)行擴增，共40個循環(huán)，每個樣品重復(fù)3次，采用2-ΔΔCt法計算各組靜脈血iRhom2 mRNA的相對表達(dá)水平。

ELISA法檢測GP Ⅴ蛋白表達(dá)：根據(jù)試劑盒說明書，使用人GP Ⅴ ELISA試劑盒(Bioswamp，貨號HM10699)定量檢測各組靜脈血GP Ⅴ蛋白水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

陰性對照組iRhom2 mRNA相對表達(dá)水平明顯高于正常對照組，GP Ⅴ蛋白表達(dá)水平明顯低于正常對照組(P<0.05)。全方組、益氣活血組iRhom2 mRNA相對表達(dá)水平明顯低于陰性對照組，GP Ⅴ蛋白表達(dá)水平明顯高于陰性對照組(P<0.05)；全方組、益氣活血組iRhom2 mRNA及GP Ⅴ表達(dá)水平與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。黃芪當(dāng)歸組iRhom2 mRNA相對表達(dá)水平明顯低于陰性對照組(P<0.05)；GP Ⅴ蛋白表達(dá)水平與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)?；钛MiRhom2 mRNA相對表達(dá)水平明顯低于陰性對照組(P<0.05)。見表1。

表1 各組iRhom2 mRNA及GP Ⅴ表達(dá)水平比較

3 討論

研究[2-3]表明，出血性血小板病患者發(fā)病過程中，iRhom2可通過與ADAM17前體蛋白結(jié)合，激活iRhom2/ADAM17信號通路，從而促進(jìn)血小板膜表面的GP Ⅴ胞外功能區(qū)過度水解，引起血小板凝血酶受體復(fù)合物活性下降，導(dǎo)致血小板聚集缺陷，引起皮膚、黏膜出血。根據(jù)本病臨床表現(xiàn)，可歸屬于中醫(yī)學(xué)“血證”范疇，益氣活血方治療本病療效顯著[1]。本次研究通過體外實驗，觀察了益氣活血方及其拆方對出血性血小板病患者全血iRhom2及GP Ⅴ表達(dá)的影響，以進(jìn)一步探討該方及其組方藥物的作用機制。

本研究結(jié)果顯示，全方組、益氣活血組iRhom2 mRNA相對表達(dá)水平明顯低于陰性對照組，GP Ⅴ蛋白表達(dá)水平明顯高于陰性對照組；全方組及益氣活血組iRhom2 mRNA及GP Ⅴ表達(dá)水平與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。表明出血性血小板病患者血液標(biāo)本中的iRhom2 mRNA及GP Ⅴ表達(dá)在益氣活血全方和益氣活血中藥的干預(yù)下，可恢復(fù)到健康人的水平。

黃芪當(dāng)歸組iRhom2 mRNA相對表達(dá)水平明顯低于陰性對照組；GP Ⅴ蛋白表達(dá)水平與正常對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。表明黃芪-當(dāng)歸藥對可起到一定治療作用?！秲?nèi)外傷辨惑論》卷中記載的當(dāng)歸補血湯，就是由當(dāng)歸與黃芪按一定比例配伍而成，具有補血益氣的功效，用于治療氣血兩虛發(fā)熱證，被稱為“氣血雙補”代表方之一。多項研究[8]表明，黃芪-當(dāng)歸藥對具有同類相須、相輔相成、相互促進(jìn)的功效，對造血系統(tǒng)疾病誘發(fā)的出血、感染、貧血及血小板聚集障礙均有明顯療效。

活血組iRhom2 mRNA相對表達(dá)水平明顯低于陰性對照組，表明活血藥物可降低出血性血小板病患者血液標(biāo)本中的iRhom2 mRNA相對表達(dá)水平，佐證中醫(yī)“活血止血，祛瘀生新”治療理論是信而有征的?；钛M藥物由當(dāng)歸、白芍、桃仁3味中藥組成，含有2個中藥藥對配伍。其一為當(dāng)歸芍藥散，最早源自東漢張仲景所著《金匱要略》，該方血水同調(diào)、治血為主，臨床上可用于治療血虛夾瘀之血小板過敏性紫癜、原發(fā)性痛經(jīng)、月經(jīng)過多等疾病[9]；體外實驗[10]提示當(dāng)歸芍藥散含藥血清對血小板聚集有顯著調(diào)節(jié)作用。其二為當(dāng)歸-桃仁藥對，《證治準(zhǔn)繩?類方》載桃仁當(dāng)歸湯具有祛血滯之功效，有學(xué)者[11]基于數(shù)據(jù)挖掘桃仁方劑配伍規(guī)律，發(fā)現(xiàn)桃仁的核心配伍組合之首為當(dāng)歸；體外實驗[12]表明當(dāng)歸-桃仁藥對不同配比對血小板聚集的調(diào)節(jié)作用均大于同等生藥劑量的當(dāng)歸和桃仁單味藥材。

復(fù)方中藥是近年來研究的熱點，其成分復(fù)雜、靶點眾多。目前應(yīng)用的干預(yù)方法主要有3種，包括中藥提取物/純化物直接添加、中藥血清藥理學(xué)及中藥血漿藥理學(xué)。3種添加方法各有利弊，是否選擇了合適的干預(yù)方法直接影響研究結(jié)果的可信度。本文的研究對象是出血性血小板病患者靜脈血標(biāo)本，用實驗動物制作中藥血清、中藥血漿無可行性，故采用中藥粗提取物直接添加。

盡管本研究嚴(yán)格按照文獻(xiàn)[5]中記載的方法去除雜質(zhì)、調(diào)整酸堿度、制成凍干粉，臨近實驗時再溶解、離心、過濾等，希冀進(jìn)一步減少中藥雜質(zhì)的理化干擾因素。但是由于中藥復(fù)方或單味中藥理化性質(zhì)復(fù)雜，中藥提取物直接添加至血液或細(xì)胞體系中影響因素仍較多。按中藥學(xué)理論，白芍具有“通順血脈，緩中，散惡血，逐賊血”功效，而本實驗結(jié)果顯示白芍組iRhom2 mRNA表達(dá)卻明顯高于陰性對照組，提示該藥不適用于治療出血性血小板病。但是在含有白芍配伍的全方組、益氣活血組及活血組中，能夠明顯降低iRhom2 mRNA表達(dá)。究竟是單味白芍可以導(dǎo)致患者全血iRhom2 mRNA高表達(dá)，還是含有雜質(zhì)的影響因素，或是中藥復(fù)方配伍后，改變了白芍的藥效，目前很難解釋。尚有待更合理的中藥體外研究方法建立，方能解決這類中藥拆方研究中的疑點及難點。

綜上所述，益氣活血方全方及其部分拆方治療出血性血小板病的機制可能與下調(diào)iRhom2 mRNA表達(dá)及上調(diào)GP Ⅴ蛋白表達(dá)有關(guān)。