李明亮，嚴建剛，朱 艷，魏 穎*，蔡木易，谷瑞增

（1 中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院 北京市蛋白質(zhì)功能肽工程技術(shù)研究中心 北京100015 2 完美（廣東）日用品有限公司 廣東中山528451）

乳清蛋白是牛乳中酪蛋白沉淀分離時保留在上清中的多種蛋白組分的統(tǒng)稱[1]。獨特的氨基酸序列和三維結(jié)構(gòu)使其具有廣泛的功能特性[2]。乳清蛋白主要成分為β-乳球蛋白、α-乳白蛋白、血清白蛋白、免疫球蛋白、糖巨肽、乳鐵蛋白、乳過氧化酶等[3]，富含支鏈氨基酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、賴氨酸、精氨酸和谷氨酰胺[4-5]，具有抗癌、抗氧化、抗菌、抗病毒、降血脂、調(diào)節(jié)免疫等作用[6]。大量體外研究證實乳清蛋白可促進益生菌增殖[7]。

豌豆（Pisum sativumLinn）是我國重要的農(nóng)作物之一，其蛋白含量在23%～25%，氨基酸組成平衡[8]，且富含豆類中較為缺乏的賴氨酸[9]。目前對豌豆蛋白功能特性的研究報道較少[10]，有研究顯示豌豆蛋白的酶解物具有促進益生菌增殖的作用[11]。

人體腸道內(nèi)寄生著大量微生物，正常情況下其種類和數(shù)量保持動態(tài)平衡，發(fā)揮著促進宿主機體發(fā)育，參與代謝，促進免疫系統(tǒng)成熟，拮抗致病菌定植等作用。蛋白質(zhì)作為重要的營養(yǎng)物質(zhì)對腸道健康的影響越來越受到人們關(guān)注[9]。腸道菌群可以參與機體蛋白質(zhì)代謝，食物蛋白會影響腸道菌群的組成與平衡，而腸道菌群的變化影響機體對蛋白質(zhì)的利用[12]。益生菌具有維持腸道菌群平衡的作用[11]。腸道菌群的調(diào)節(jié)和腸道微環(huán)境的改善，可以通過外源補充益生菌實現(xiàn)[13]。益生菌發(fā)揮作用必須達到足夠的數(shù)量，國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定添加到益生菌產(chǎn)品中的活菌數(shù)應(yīng)不小于106CFU/g（或mL）[14]。

腸道菌群紊亂狀況在抗生素日益濫用的今天愈發(fā)嚴重，主要表現(xiàn)為有益菌數(shù)量減少和致病菌數(shù)量增多[15]。腸道菌群紊亂和多樣性降低將導(dǎo)致宿主代謝紊亂，免疫系統(tǒng)受到影響，進而威脅宿主健康[16-17]。為了探究乳清蛋白和豌豆蛋白以及蛋白和益生菌聯(lián)合作用對抗生素導(dǎo)致的腸道菌群紊亂的調(diào)節(jié)作用，本試驗通過灌胃鹽酸林可霉素建立腸道菌群紊亂小鼠模型，對模型小鼠進行蛋白樣品及蛋白與益生菌聯(lián)合干預(yù)處理。干預(yù)結(jié)束后對小鼠盲腸內(nèi)容物進行菌群計數(shù)，評價小鼠腸道微生物的定植抗力，對小鼠糞便中細菌基因組DNA進行16S rDNA 測序，研究不同樣品的干預(yù)對腸道菌群紊亂小鼠的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乳清蛋白、豌豆蛋白、豌豆適度水解蛋白肽、益生菌粉，由北京中食海氏生物技術(shù)有限公司（SEA SON）提供，其中豌豆適度水解蛋白肽為豌豆蛋白經(jīng)蛋白酶適度水解后的產(chǎn)物；鹽酸林可霉素，北京索萊寶科技有限公司；雙歧桿菌培養(yǎng)基（BBL）、乳酸桿菌培養(yǎng)基（MRS）、大腸桿菌培養(yǎng)基（EMB）、腸球菌培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

1.2 實驗動物

6～8 周齡雄性SPF 級昆明小鼠，體重（38±3）g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)溫度（20±2）℃，動物經(jīng)7 d 適應(yīng)性喂養(yǎng)后用于實驗，實驗期間自由進食和飲水。

1.3 試驗方法

1.3.1 動物分組和模型建立 將小鼠隨機分為空白組（A）、模型組（B）、乳清蛋白組（C）、乳清蛋白+益生菌組（D）、豌豆蛋白組（E）、豌豆蛋白+益生菌組（F）、豌豆適度水解蛋白肽組（G）、豌豆適度水解蛋白肽+益生菌組（H），每組5 只。除空白組外，其余各組每天灌胃鹽酸林可霉素，每日2 次，每次90 mg，連續(xù)3 d，建立腸道菌群紊亂模型?？瞻捉M灌胃相同體積生理鹽水。

各處理組連續(xù)灌胃相應(yīng)樣品14 d，灌胃劑量為200 mg/（kg·bw），其中益生菌添加量為108CFU/g 蛋白，空白組和模型組灌胃相同體積的生理鹽水。

1.3.2 樣本采集與檢測 灌胃結(jié)束后，按照分組收集小鼠新鮮糞便，經(jīng)液氮速凍后置于-80 ℃保存，用于細菌基因組DNA 提取和16S rDNA 測序分析。小鼠經(jīng)麻醉后處死，無菌條件下收集盲腸內(nèi)容物，置于干燥滅菌試管中，取1 g 內(nèi)容物樣品加入9 mL 無菌生理鹽水，震蕩至內(nèi)容物完全擴散，隨后對樣品進行梯度稀釋，取100 μL 相應(yīng)倍數(shù)的稀釋液涂布于目標(biāo)菌的選擇培養(yǎng)基上，每個分組中每種培養(yǎng)基涂布3 個平行。各目標(biāo)菌的稀釋倍數(shù)由預(yù)試驗確定，其中腸球菌稀釋倍數(shù)為1×103倍，大腸桿菌、乳酸桿菌和雙歧桿菌稀釋倍數(shù)為1×106倍，大腸桿菌和腸球菌在37 ℃需氧條件下于選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，乳酸桿菌和雙歧桿菌在37 ℃厭氧條件下于選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h，之后進行計數(shù)。根據(jù)所得菌落數(shù)和稀釋倍數(shù)以及涂布量計算每克內(nèi)容物中細菌含量，結(jié)果以對數(shù)值表示。

1.3.3 生物信息分析 16S rDNA 位于原核生物細胞核糖體小亞基上，其保守區(qū)在細菌間無明顯差異，高變區(qū)則具有屬或種的特異性，因此16S rDNA 可以作為揭示生物物種的特征核酸序列，被認為是最適于細菌分類鑒定的指標(biāo)[18-20]。

本試驗首先從小鼠糞便中提取細菌基因組DNA，并檢測DNA 的純度和濃度，DNA 樣品稀釋至1 ng/μL 后進行PCR 擴增，擴增產(chǎn)物進行等量混樣，并對產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測、純化和回收，構(gòu)建小片段文庫，基于Illumina NovaSeq 測序平臺對該文庫進行雙末端測序，對測序得到的原始數(shù)據(jù)進行拼接和過濾得到有效數(shù)據(jù)，基于有效數(shù)據(jù)以97%一致性利用Uparse 軟件進行可操作分類單元（OTUs）聚類和物種分類分析，然后使用KRONA 軟件對OTUs 的序列進行物種注釋。

對OTUs 進行豐度、α 多樣性計算、花瓣圖等分析，以得到樣本內(nèi)物種豐富度和均勻度信息、不同分組間共有和特有OTUs 信息等；對OTUs 進行多序列比對并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，通過主坐標(biāo)分析（PCoA）、主成分分析（PCA）、無度量多維標(biāo)定法（NMDS）等降維分析和樣本聚類樹展示，探究不同組別間群落結(jié)構(gòu)的差異；對擴增子的注釋結(jié)果與京都基因與基因組百科全書（KEGG）功能數(shù)據(jù)庫相關(guān)聯(lián)，用Tax4Fun 軟件對樣本中微生物群落進行功能預(yù)測分析。Tax4Fun 是一款基于16S Silva數(shù)據(jù)庫的用于腸道等環(huán)境樣本功能預(yù)測的程序包[21]。首先提取KEGG 數(shù)據(jù)庫原核生物全基因組16S rDNA 基因序列并利用BLASTN 算法將其比對到SILVA 數(shù)據(jù)庫建立相關(guān)矩陣，其次將經(jīng)過注釋的全基因組功能信息對應(yīng)到SILVA 數(shù)據(jù)庫中，從而實現(xiàn)SILVA 數(shù)據(jù)庫功能注釋。

1.4 統(tǒng)計分析

采用Prism 8.0 軟件對數(shù)據(jù)進行處理，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）和多重比較（Multiple comparisons），試驗結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，P<0.05 具有顯著性差異，P<0.01 具有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 盲腸內(nèi)容物中菌群計數(shù)結(jié)果

菌群計數(shù)結(jié)果如表1所示，可以看出，模型組（B）中腸球菌數(shù)量相比于空白組（A）極顯著升高（P＜0.01），大腸桿菌數(shù)量有所升高但無顯著性差異，乳酸桿菌數(shù)量極顯著升高（P＜0.01），雙歧桿菌數(shù)量顯著降低（P＜0.05），B/E值極顯著降低（P＜0.01），說明模型組小鼠腸道菌群定植抗力顯著下降，存在明顯的紊亂狀況。相比于模型組（B），各處理組的B/E值都有所提高，其中僅乳清蛋白組（C）相比于B 組有顯著性差異（P＜0.05），說明乳清蛋白可以最顯著提高腸道菌群的定植抗力，減少致病菌的定植和增殖；豌豆適度水解蛋白肽組（G）的B/E值略高于豌豆蛋白組（E），說明豌豆適度水解蛋白肽對腸道菌群定植抗力的提升作用略強于豌豆蛋白，各蛋白樣品單獨或與益生菌聯(lián)合作用時B/E值并無顯著差異。

表1 小鼠盲腸內(nèi)容物菌群計數(shù)【lg（CFU/g）濕重】Table 1 Count of bacterial cecum contents in mice[lg（CFU/g）FW]

2.2 基于OTU 的花瓣圖

根據(jù)聚類得到OTUs 結(jié)果，分析不同組之間共有、特有的OTUs，花瓣圖的繪制是對所有樣本進行均一化處理之后進行的。

由圖1 可以看出，所有分組的共有OTUs 數(shù)目為29 個，其中空白組（A）特有OTUs 數(shù)目為4個，模型組（B）特有OTUs 數(shù)目為22 個，說明經(jīng)造模處理后，模型組（B）小鼠腸道菌群的物種組成相比于空白組發(fā)生了顯著變化，除豌豆蛋白組（E）外各處理組的特有OTUs 數(shù)目相比于模型組皆顯著下降，說明樣品干預(yù)可使模型小鼠腸道菌群組成產(chǎn)生明顯改變，E 組特有OTUs 數(shù)目高于空白組和模型組，提示該組中物種豐富度可能最高。

圖1 基于OTUs 的花瓣圖Fig.1 Flower graph based on OTUs

2.3 門、屬、種分類水平上的物種相對豐度

根據(jù)物種注釋結(jié)果，選取每個分組在門、屬、種分類水平上最大豐度排名前10 的物種，繪制物種相對豐度柱形累加圖，了解主要物種在各分組中的分布情況，便于發(fā)現(xiàn)各組中和各組之間優(yōu)勢物種的差異。

由圖2 可以看出，各組樣本中豐度最高的3個門為厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和變形菌門（Proteobacteria）。厚壁菌門和擬桿菌門是腸道內(nèi)的優(yōu)勢有益菌，厚壁菌門主要對碳水化合物和蛋白質(zhì)進行水解，通過產(chǎn)生丁酸抑制結(jié)腸腫瘤細胞增殖；擬桿菌門主要作用于類固醇、多糖和膽汁酸，促進機體對多糖的吸收，通過生成乙酸和丙酸抑制腫瘤壞死因子α（TNFα）的釋放[23-24]。研究顯示，肥胖患者腸道中厚壁菌門數(shù)量增多，擬桿菌門數(shù)量減少[25]。變形菌門包含多種致病菌，易導(dǎo)致腸道疾病[26]?？瞻捉M（A）中這3 個門相對豐度分別為32.50%，63.10%，4.09%，模型組（B）中這3 個門相對豐度分別為99.26%，0.20%，0.50%，可以看出B 組中厚壁菌門過度增殖，其相對豐度相比于A 組顯著升高，而其它門中物種數(shù)量則顯著降低；各處理組中厚壁菌門相對豐度顯著下降，其余各門物種相對豐度升高且趨向于正常水平，說明樣品干預(yù)有效改變了小鼠腸道菌群組成，改善了菌群紊亂的狀況。

圖2 門水平上的物種相對豐度柱形圖Fig.2 Histogram of relative abundance of species at the phylum level

由圖3 可以看出，空白組（A）中相對豐度最高的10 個屬分別為：擬桿菌屬（Bacteroides，38.62%）、狄氏副擬桿菌屬（Parabacteroides，16.06%）、Lachnoclostridium（11.09%）、布勞特氏菌屬（Blautia，6.49%）、不明丹毒絲菌科（Unidentified_Erysipelotrichaceae，4.54%）、不明梭菌目（Unidentified_Clostridiales）（2.40%）、多枝梭菌屬（Erysipelatoclostridium，1.79% ）、羅賓氏菌屬（Robinsoniella，1.50%）、擬普雷沃菌屬（Alloprevotella，0.82%）、腸球菌屬（Enterococcus，0.04%），總占比達到83.34%，模型組（B）中腸球菌屬和不明梭菌目過度增殖，相對豐度相比于A 組顯著升高，分別為57.23%和39.45%，其余屬物種相對豐度皆顯著下降，豐度前10 的屬物種總占比為97.78%，說明模型組（B）的物種豐富度相比于A組顯著降低。腸球菌是常見的致病菌，可導(dǎo)致尿路感染等疾病，且對許多抗菌藥物有耐藥性，其耐藥性可能是經(jīng)造模處理后該菌在菌群中所占比例顯著升高的原因。各處理組中腸球菌屬相對豐度相比于B 組皆顯著降低，其余屬物種相對豐度升高，說明樣品干預(yù)可以抑制小鼠腸道中致病菌的增殖，恢復(fù)腸道菌群的物種多樣性。

圖3 屬水平上的物種相對豐度柱形圖Fig.3 Histogram of relative abundance of species at the genus level

由圖4 可以看出，空白組（A）中相對豐度最高的10 種菌分別為：糞便擬桿菌（Bacteroides stercorirosoris，22.38%）、狄氏副擬桿菌（Parabacteroides distasonis，15.78%）、多形擬桿菌（Bacteroides thetaiotaomicron，10.44% ）、梭狀梭菌（Clostridium clostridioforme，8.63%）、布勞特氏菌（Blautiasp.YL58，5.55%）、無害梭菌（Clostridium innocuum，4.54%）、第三梭菌（Clostridium tertium，2.39%）、羅賓氏菌（Robinsoniella peoriensis，1.50%）、鉛黃腸球菌（Enterococcus casseliflavus，0.04% ）、雙孢梭菌（Clostridium disporicum，0.01%），模型組（B）中鉛黃腸球菌（57.15%）、第三梭菌（19.79%）和雙孢梭菌（19.66%）相對豐度相比于A 組皆顯著增加，其中鉛黃腸球菌可引起抵抗力低下宿主的多種機會性感染[27]，第三梭菌作為病原體被報道的次數(shù)近年來逐漸增加，但其致病機制尚不清楚[28]，說明模型小鼠腸道中致病菌數(shù)量相比于正常小鼠顯著增加；各處理組中鉛黃腸球菌、第三梭菌、雙孢梭菌比例相比于模型組皆顯著降低，其余各菌種相對豐度顯著升高且趨向于正常水平，說明樣品干預(yù)可以有效降低小鼠腸道中致病菌相對豐度，促進有益菌或中性菌增殖，起到恢復(fù)腸道菌群穩(wěn)態(tài)的作用。

圖4 種水平上的物種相對豐度柱形圖Fig.4 Histogram of relative abundance of species at the species level

2.4 物種多樣性曲線

稀釋曲線可反映測序數(shù)據(jù)量的合理性和物種的豐富程度。等級聚類曲線可反映樣本中物種的豐富度和均勻度：曲線在橫軸上跨度越大，物種的豐富度越高，曲線越平緩，物種分布越均勻[29]。

由圖5 可以看出，稀釋曲線隨測序量的增加趨向平坦，說明測序數(shù)據(jù)量合理，同時可以看出豌豆蛋白組（E）擁有最高的物種豐富度。

圖5 稀釋曲線Fig.5 Rarefaction curve

由圖6 可以看出，乳清蛋白組（C）、豌豆蛋白組（E）、豌豆適度水解蛋白肽+益生菌組（H）的曲線在橫軸上跨度大于空白組（A），說明物種豐富度大于A 組，其余各組的曲線在橫軸上跨度小于A組，說明物種豐富度小于A 組，模型組（B）曲線在橫軸上跨度最小，說明B 組物種豐富度最低；B 組曲線整體上平緩度最差，說明B 組中物種分布不均勻，除B 組外各組曲線尤其是E 組的曲線相對平緩，僅在末端出現(xiàn)較大曲折，說明各組尤其是E組的樣本中物種分布較為均勻。

圖6 等級聚類曲線Fig.6 Rank abundance curve

2.5 降維分析

2.5.1 PCoA 分析 PCoA 分析是通過一系列的特征值和特征向量排序從多維數(shù)據(jù)中提取出最主要的元素和結(jié)構(gòu)[30]。本試驗基于Weighted Unifrac 距離進行PCoA 分析，并選取貢獻率最大的主坐標(biāo)組合進行作圖。樣本距離越接近，表示物種組成結(jié)構(gòu)越相似。

由圖7 可以看出，模型組（B）與空白組（A）明顯分開，說明兩組之間物種組成結(jié)構(gòu)差異顯著，各處理組與A 組之間的距離相比于B 組與A 組之間的距離都得到明顯縮短，說明經(jīng)樣品干預(yù)后各組小鼠腸道菌群組成結(jié)構(gòu)趨向于A 組，其中豌豆蛋白組（E）、豌豆蛋白+益生菌組（F）、豌豆適度水解蛋白肽組（G）、豌豆適度水解蛋白肽+益生菌組（H）與A 組較為接近，而乳清蛋白組（C）和乳清蛋白+益生菌組（D）與A 組仍有較大差異。

圖7 基于Weighted Unifrac 距離的PCoA 分析Fig.7 PCoA analysis based on Weighted Unifrac distance

2.5.2 PCA 分析 PCA 分析是一種對多維數(shù)據(jù)進行降維從而提取出數(shù)據(jù)中最主要的元素和結(jié)構(gòu)的方法[31-32]。樣本的群落組成越相似，它們在PCA 圖中的距離越接近。

由圖8 可以看出，模型組（B）與空白組（A）明顯分開，說明兩組樣本之間群落組成差異顯著，除豌豆蛋白組（E）外，各處理組與A 組之間距離相比于B 組和A 組之間距離得到明顯縮短，說明經(jīng)樣品干預(yù)后小鼠腸道菌落組成趨近于正常水平。

圖8 PCA 分析Fig.8 PCA analysis

2.5.3 NMDS 分析 NMDS 統(tǒng)計可以克服線性模型的缺點，反映數(shù)據(jù)的非線性結(jié)構(gòu)[33-34]。不同樣本間的差異程度通過點與點間的距離體現(xiàn)。

由圖9 可以看出，空白組（A）與模型組（B）之間距離最遠，說明兩組樣本之間差異最大，各處理組與A 組之間的距離相比于B 組和A 組之間的距離得到明顯縮短，說明經(jīng)樣品干預(yù)后各組與A組之間的差異明顯縮小，其中乳清蛋白+益生菌組（D）、豌豆蛋白+益生菌組（F）和豌豆適度水解蛋白肽組（G）與A 組之間的差異相對較小。

圖9 NMDS 分析Fig.9 NMDS analysis

2.6 UPGMA 聚類樹

UPGMA 是一種較為常用的聚類分析方法[35]，以Weighted Unifrac 距離矩陣做UPGMA 聚類分析，通過UPGMA 聚類樹可以對樣本進行等級聚類，更清晰的看到樣本間的相似性聚類情況。

由圖10 可以看出，空白組（A）和豌豆蛋白組（E）成簇，豌豆適度水解蛋白肽組（G）和豌豆適度水解蛋白肽+益生菌組（H）成簇，乳清蛋白組（C）和乳清蛋白+益生菌組（D）成簇，豌豆蛋白+益生菌組（F）、模型組（B）單獨成簇，A 組與B 組樣本組成差異最大，處理組中E 組、G 組、H 組、F 組與A組樣本組成較為接近，而C 組和D 組與A 組存在較大差異。

圖10 基于Weighted Unifrac 距離的UPGMA 聚類樹Fig.10 UPGMA clustering tree based on Weighted Unifrac distance

2.7 Tax4Fun 功能預(yù)測

2.7.1 功能相對豐度聚類分析 KEGG 數(shù)據(jù)庫將生物通路劃分為6 類：細胞進程（Cellular Processes）、環(huán)境信息處理（Environmental Information Processing）、遺傳信息處理（Genetic Information Processing）、人類疾?。℉uman Diseases）、新陳代謝（Metabolism）和有機系統(tǒng)（Organismal Systems）。

由圖11 可以看出，空白組（A）中功能相對豐度分別為新陳代謝（47.89%）、遺傳信息處理（22.22%）、環(huán)境信息處理（12.34%）、細胞進程（6.97%）、人類疾?。?.95%）和有機系統(tǒng)（2.03%），模型組（B）中環(huán)境信息處理（15.47%）、人類疾?。?.44%）、遺傳信息處理（24.46%）功能相對豐度相比于A 組明顯升高，新陳代謝（43.78%）、細胞進程（6.04%）和有機系統(tǒng)（1.31%）功能相對豐度相比于A 組明顯降低；各處理組的環(huán)境信息處理、人類疾病和遺傳信息處理功能相對豐度相比于B 組明顯降低，新陳代謝、細胞進程、有機系統(tǒng)功能相對豐度相比于B 組明顯升高，說明經(jīng)樣品干預(yù)后各組樣本的功能基因組成得到改善。

圖11 Tax4Fun 功能注釋聚類熱圖Fig.11 Tax4Fun function annotation clustering heat map

選取豐度排名前35 的功能及其豐度信息繪制熱圖并聚類，結(jié)果如圖12所示。相比于空白組（A）、模型組（B）中樣本功能相對豐度明顯改變，如與碳水化合物、萜類、聚酮、聚糖、脂質(zhì)和氨基酸代謝以及能量、運輸和分解代謝相關(guān)的功能相對豐度總計下降了4.63%，免疫系統(tǒng)功能相對豐度降低了0.19%，細胞生長與死亡功能相對豐度降低了0.25%，細胞運動功能相對豐度降低了0.11%，酶功能相對豐度降低了0.20%，內(nèi)分泌功能相對豐度降低了0.23%，神經(jīng)系統(tǒng)功能相對豐度降低了0.15%，細胞過程與信號功能相對豐度降低了0.38%，其它次生代謝物合成功能相對豐度降低了0.58%，傳染性疾病功能相對豐度提高了0.31%，耐藥性功能相對豐度提高了0.26%，異生物素的生物降解和新陳代謝功能相對豐度提高了0.28%，膜運輸功能相對豐度提高了2.80%，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能相對豐度提高了0.30%，與DNA 復(fù)制、修復(fù)、轉(zhuǎn)錄、翻譯以及遺傳信息處理和核苷酸代謝有關(guān)的功能相對豐度提高了3.43%；各處理組的樣本功能相對豐度相比于模型組有了顯著改變，且趨向于正常水平。

圖12 Tax4Fun 功能注釋聚類熱圖Fig.12 Tax4Fun function annotation clustering heat map

2.7.2 功能注釋PCA 分析 將數(shù)據(jù)庫功能注釋的豐度統(tǒng)計結(jié)果進行PCA 降維分析，樣本的功能組成越相似，它們在降維圖中的距離越接近。

由圖13 可以看出，空白組（A）與模型組（B）距離最遠，說明兩組之間樣本功能組成差異最大，各處理組與空白組之間的距離相比于B 組與A組之間的距離顯著縮短，說明經(jīng)樣品干預(yù)后模型小鼠腸道菌群的功能組成趨向于正常水平，其中豌豆適度水解蛋白肽+益生菌組（H）與A 組最接近，說明該組樣本的功能組成與正常水平最接近。

圖13 Tax4Fun 功能注釋PCA 結(jié)果Fig.13 Tax4Fun function annotation PCA results

3 結(jié)論

鹽酸林可霉素屬于窄譜抗菌藥，短期內(nèi)大量給藥可造成小鼠腸道菌群失調(diào)[36]。本試驗結(jié)果顯示經(jīng)鹽酸林可霉素處理后，小鼠腸道菌群定植抗力顯著降低，菌群組成結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變，物種豐富度和多樣性顯著降低，致病菌數(shù)量顯著增加，菌群功能基因組成也產(chǎn)生顯著變化。

盲腸內(nèi)容物菌群計數(shù)結(jié)果顯示乳清蛋白可顯著提高腸道微生物的定植抗力；物種多樣性曲線顯示豌豆蛋白可最顯著提高腸道菌群的物種豐富度和多樣性；降維分析顯示不同處理組小鼠的腸道菌群組成結(jié)構(gòu)都趨向于空白組水平，綜合降維分析和聚類分析結(jié)果，物種組成與空白組最相似的為豌豆適度水解蛋白肽組。功能預(yù)測結(jié)果顯示，不同蛋白樣品的干預(yù)處理都可改變模型小鼠腸道菌群的功能基因組成，使其趨向于空白組水平，其中豌豆適度水解蛋白肽+益生菌處理組與空白組水平最接近。

綜上所述，乳清蛋白、豌豆蛋白和豌豆適度水解蛋白肽都可調(diào)節(jié)和改善抗生素導(dǎo)致的腸道菌群紊亂狀況，其中乳清蛋白可以顯著提升腸道微生物的定植抗力，豌豆蛋白可最大程度的提高腸道菌群的物種豐富度和多樣性，而豌豆適度水解蛋白肽可以使腸道菌群物種組成結(jié)構(gòu)最大程度的恢復(fù)至正常水平，與益生菌聯(lián)合作用時，還可以調(diào)節(jié)菌群功能基因組成，使其最大程度的趨向于正常水平。