潘蔣娟，李培駿*，蘇東林，趙志遠，李高陽，單 楊

（1 桂林理工大學化學與生物工程學院 廣西桂林541004 2 湖南省農(nóng)產(chǎn)品加工研究所 長沙410125 3 果蔬加工與質(zhì)量安全國際聯(lián)合實驗室 長沙410125 4 湖南省農(nóng)業(yè)科學院 長沙410125 5 果蔬貯藏加工與質(zhì)量安全湖南省重點實驗室 長沙410125）

銀納米粒子（Silver nanoparticles，AgNPs）是以納米技術(shù)為基礎(chǔ)研制而成的新型納米材料，粒徑介于1～100 nm 之間，具有比表面積大、尺寸小、強表面活性、強催化性能等特點，廣泛應用于醫(yī)療、食品、陶瓷、光學、紡織、化妝品、催化劑、半導體材料、低溫導熱材料、水質(zhì)凈化等方面[1-3]。銀離子對多種革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、霉菌等均有廣譜、強烈的殺滅作用，這是其作為抗菌材料被研究的基礎(chǔ)[4]。已知基于金屬的納米顆粒具有非特異性細菌毒性機制（它們不與細菌細胞中的特定受體結(jié)合），這不僅使細菌難以產(chǎn)生耐藥性，而且擴大了抗菌活性的范圍[5]。這些顆粒被提議作為傳統(tǒng)抗生素的替代品，以克服細菌的耐藥性。

AgNPs 對于細菌和霉菌等650 種微生物都具有抗菌活性[6]。目前認為AgNPs 的抗菌機制有4種：1）黏附到細胞壁和細胞膜的表面；2）滲透到細胞內(nèi)部，并破壞細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)（線粒體、空泡和核糖體）和生物大分子（蛋白質(zhì)、脂類和DNA）；3）誘導細胞毒性，通過產(chǎn)生自由基誘導氧化應激；4）調(diào)節(jié)信號傳導途徑。此外，還可以通過靶向免疫反應調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)[7]?？梢?，AgNPs 抗菌是一個綜合的生物過程，涉及微生物細胞、生物大分子、基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達等，這些過程相互關(guān)聯(lián)，互為因果。在這些生物過程中，活性氧（ROS）誘導的氧化應激發(fā)揮了極其重要的作用。

AgNPs 會導致不同類型細胞內(nèi)活性氧聚集，發(fā)生氧化應激反應并導致細胞損傷、調(diào)亡等現(xiàn)象。明確AgNPs 抗菌活性機制對于客觀評價其安全性，合理制備使用AgNPs 十分關(guān)鍵。本文結(jié)合以往關(guān)于AgNPs 脅迫微生物產(chǎn)生氧化應激，及其在細胞水平、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組對細胞毒性的影響研究來探究AgNPs 的氧化應激機制和抗菌作用的分子機理。

1 氧化應激的產(chǎn)生

氧化應激是指由于種種原因，機體有氧代謝產(chǎn)生的ROS 增多或機體自行清除的ROS 減少，對大多數(shù)細胞產(chǎn)生毒性作用，導致細胞的DNA、蛋白質(zhì)和脂類破壞的病理性生物化學反應。大量研究表明，細胞內(nèi)的ROS 主要由線粒體產(chǎn)生，是體內(nèi)一類氧的單電子還原產(chǎn)物，當細胞內(nèi)的氧被還原為自由基超氧陰離子（O2-）、過氧化氫（H2O2）和羥自由基（·OH）后，就產(chǎn)生了ROS[8]。細胞內(nèi)高水平的ROS，特別是O2-和H2O2，不僅會使酶活性降低，導致生長停止，也會導致DNA 損傷，加速基因突變[9-10]。在正常條件下，ROS 的產(chǎn)生和細胞中的抗氧化能力是平衡的。然而，當產(chǎn)生的ROS 超過細胞的抗氧化能力時，細胞正常機能遭破壞，導致氧化應激[11]。納米粒子（NP）抗菌機制涉及NP 與細胞表面之間的直接相互作用，這會影響納米顆粒進入并誘導氧化應激的膜的通透性，從而導致細胞生長受到抑制，并最終導致細胞死亡[12]。為了克服這種應激，細胞做出了酶或非酶的保護性反應。當氧化應激超出了細胞防御體系，細胞壁和生物大分子就會被ROS 和其自由基破壞[8]。

目前，金屬納米顆粒誘導細胞內(nèi)ROS 水平升高的原因主要有3 個：1）顆粒的細胞攝取，2）金屬離子的細胞外/內(nèi)釋放，3）在蛋白表面上的吸附，所有這些因素結(jié)合的結(jié)果誘導了細胞的氧化應激[13]。圖1 表示植物和微生物細胞氧化應激的產(chǎn)生及其導致的細胞損傷作用[14]。

圖1 納米材料（NMs）抗菌的作用機理[14]Fig.1 Antimicrobial mechanism of nanomaterials[14]

2 氧化應激對微生物細胞的影響

生物信息學分析表明，干擾細胞膜功能和提高細胞內(nèi)ROS 的產(chǎn)生是AgNPs 產(chǎn)生抗菌作用的主要途徑，這表明AgNPs 可能通過影響細胞膜并釋放銀離子與蛋白質(zhì)反應使細胞處于氧化應激狀態(tài)。相對于銀離子而言，細胞內(nèi)ROS 的升高證實了AgNPs 引起的氧化損傷，這可能歸因于納米特性和更高的顆粒吸收效率。

首先，自由基和ROS 可以損傷細胞膜和電子傳遞鏈。AgNPs 與微生物的相互作用，開始是帶較少正電荷的AgNPs 與負電荷的微生物細胞壁和細胞膜相靠近，產(chǎn)生靜電吸引[15]。然后導致Zeta 電位下降，細胞膜形態(tài)改變，破壞細胞膜透過性和呼吸功能，最終破壞了細胞的完整性從而使細胞死亡[16]。Quinteros 等[17]利用AgNPs 使金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和綠膿桿菌中ROS 增加，證明了氧化應激是通過DNA、細胞膜脂質(zhì)和蛋白質(zhì)水平的大分子氧化來產(chǎn)生的。Kora 等[18]的研究證實了ROS 對AgNPs 的抗菌作用與膜損傷具有關(guān)聯(lián)，并證明了AgNPs 使細胞內(nèi)產(chǎn)生ROS。納米粒子可以通過擾亂氧化劑和抗氧化過程之間的平衡來加速細胞內(nèi)氧化應激，造成致病菌體內(nèi)ROS 的積累量超過正常水平，進而導致細胞死亡。Perez-Gutierrez 等[19]研究了對暴露于H2O2條件下的胰島β 細胞（INS-1）的保護作用，得出納米復合材料可以通過保護氧化酶的嚴重耗竭或通過直接清除ROS 來減輕H2O2誘導的細胞內(nèi)氧化應激，這在維持β 細胞生理抗氧化應激中具有重要作用。

納米材料通過產(chǎn)生ROS 引起氧化應激，并對細胞成分造成破壞，包括DNA 破壞，轉(zhuǎn)錄因子的異常激活，抗氧化劑分子的消耗，蛋白質(zhì)的結(jié)合和喪失能力，并損害細胞膜[20]。氧化應激誘導ROS 可能導致線粒體損傷和脂質(zhì)過氧化[21-22]。特別是，已經(jīng)報道了ROS 的產(chǎn)生及其與細胞中的氧化應激的關(guān)系。氧化應激不僅會導致細胞中理化性質(zhì)的改變，還會破壞線粒體并導致線粒體形態(tài)發(fā)生急劇變化。已知各種類型的納米顆粒通過產(chǎn)生細胞內(nèi)ROS 來誘導氧化應激。細胞攝取納米顆粒和細胞內(nèi)金屬離子的釋放是細胞內(nèi)ROS 產(chǎn)生的重要因素。此外，ROS 的產(chǎn)生可能是由于納米顆粒與細胞的相互作用導致線粒體功能障礙。體內(nèi)納米顆粒誘導細胞因子的分泌，而細胞因子的分泌又通過產(chǎn)生ROS 和自由基而引起次級氧化應激[13]。Yoshimoto 等[23]發(fā)現(xiàn)二甲苯誘導線粒體斷裂和Yap1 的核積累，Yap1 是氧化應激響應轉(zhuǎn)錄因子，在用二甲苯處理的酵母細胞中可激活靶基因GPX2和TRX2的轉(zhuǎn)錄激活，表明二甲苯能夠引起酵母細胞中的氧化應激。氧化應激的另一個重要影響是電子傳遞鏈，AgNPs 釋放Ag+介導產(chǎn)生ROS，能夠?qū)е录毦鷧⑴c電子傳遞鏈和質(zhì)子動勢的酶失活，從而使其功能喪失。AgNPs 產(chǎn)生的ROS使膜的滲透性增加，導致了蛋白質(zhì)的泄露。而且由于氧化應激，一種重要的呼吸酶乳酸脫氫酶（LDH）活性顯著降低，說明ROS 影響呼吸鏈的活性。Gomma[24]采用比色法研究了AgNPs 對于大腸桿菌和金黃色葡萄球菌細胞呼吸鏈酶脫氫酶的活力，經(jīng)AgNPs 作用后，其酶活力隨時間下降。這些結(jié)果表明AgNPs 嚴重破壞了細胞膜和肽聚糖，進入細胞抑制呼吸鏈脫氫酶，從而導致細胞死亡。

其次，微生物生命中的氧化應激是ROS 產(chǎn)生與細胞中和其有害作用的能力之間的不平衡。細菌可以多種方式對氧化應激做出反應，一些分子組成存在并有助于維持細胞內(nèi)還原環(huán)境或化學清除ROS。此外，特定的酶可降低ROS 的恒定水平，包括過氧化氫酶和超氧化物歧化酶（SOD）。SOD是主要的抗氧化防御酶之一，可對氧化應激做出反應，并將高毒性的超氧陰離子轉(zhuǎn)化為過氧化氫。El-Houseiny 等[25]通過研究發(fā)現(xiàn)嗜水氣單胞菌感染的群體有顯著升高丙二醛（MDA）水平，說明細菌副產(chǎn)物可引起氧化應激，導致細胞壁和ROS 脂質(zhì)過氧化增加而導致的MDA 水平升高。Hendiani等[26]通過在銅綠假單胞菌ATCC 27853 中用亞甲藍（MB）處理下調(diào)了4 個研究的群體感應（QS）基因，即lasI，lasR，rhII和rhlR。pslA和pelF基因也觀察到表達。pslA 和pelF 是psl 和Pel 多糖生物合成的生化途徑中必不可少的酶。微生物為了應對AgNPs 的氧化應激，胞內(nèi)的解毒酶的活性也會發(fā)生變化。Yuan 等[27]研究發(fā)現(xiàn)AgNPs 處理能夠提高MDA 水平，而MDA 可以作為脂質(zhì)過氧化物氧化應激的標記物；而且，經(jīng)AgNPs 處理的菌上調(diào)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GSH）、下調(diào)了GSH、SOD 和過氧化氫酶（CAT）的活性。除此之外，氧化應激可以導致DNA 損傷，氧化DNA 前體能夠與DNA 反應并導致DNA 損傷，通過DNA 修補機制可以恢復破壞的DNA[28]。

AgNPs 產(chǎn)生的氧化應激除了對細菌造成影響，還能夠?qū)φ婧思毎a(chǎn)生毒性影響。自由基和氧化應激與許多病理改變及疾病發(fā)生有關(guān)。據(jù)報道，動物和人類經(jīng)常通過吸入、皮膚接觸和口服途徑接觸AgNPs[20]。作為體外模型，細胞系經(jīng)常用于測試不同納米材料的毒性作用。例如，若干研究已經(jīng)證明，AgNPs 通過氧化應激使小鼠和大鼠細胞凋亡[29]。較小粒徑的AgNPs 可以輕易進入并分布在整個細胞質(zhì)細胞器中[30]。然而，據(jù)報道較小的Ag-NPs（6 nm）對小鼠成纖維細胞系和人角質(zhì)形成細胞系無毒[31]。張幫勇[32]以人肺癌細胞（A549）和人肝癌細胞（HepG2）為研究對象，探究AgNPs 對A549 和HepG2 細胞氧化應激作用，并探討氧化應激與細胞毒作用關(guān)系。這是在細胞和分子水平上探究AgNPs 對A549 和HepG2 細胞毒作用機制及其差異原因，為AgNPs 的安全性評價以及應用提供毒理學資料。張斌[33]以小鼠原代肝細胞為模型，在細胞水平上對比研究了不同粒徑銀納米粒子誘發(fā)細胞氧化應激的情況，對比研究了2 種粒徑AgNPs 誘導細胞產(chǎn)生氧化應激的機制。結(jié)果證明：AgNPs 可誘發(fā)細胞出現(xiàn)氧化應激，且粒徑小的AgNPs 比粒徑大的AgNPs 毒性更大。Matsumoto等[34]發(fā)現(xiàn)ROS 的增加會引起組織對血管內(nèi)皮細胞以及包括胰腺和角膜在內(nèi)的上皮組織的損傷，發(fā)現(xiàn)高血糖誘導的ROS 產(chǎn)生促進唾液腺損傷并導致唾液分泌不足的新機制。由此可見，氧化應激對細胞造成的損傷是多方面的。

3 氧化應激對微生物基因表達和調(diào)控的影響

氧化應激是指ROS 的產(chǎn)生與活細胞和組織中導致炎癥過程的抗氧化防御機制之間的不平衡。Wunnoo 等[35]使用桉樹葉提取物一步法生物合成了bio-AgNPs，對念珠菌生物膜具有抑制作用，研究表明編碼菌絲體生成和參與水解酶的基因表達下調(diào)，bio-AgNPs 用作抗氧化劑以預防與氧化應激相關(guān)的人類疾病。同時，AgNPs 可以用作念珠菌治療的抗真菌劑，也可以摻入醫(yī)療設(shè)備中以防止生物膜形成。除了對于細胞壁和細胞膜的直接影響之外，ROS 還通過激活氧化還原敏感轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)基因的表達，并通過調(diào)節(jié)信號轉(zhuǎn)導引發(fā)反應[36]。Piersanti 等[37]通過分析RNA-seq 的基因表達譜，使用纖毛狀四膜蟲嗜熱菌闡明了AgNPs 的作用機理，并將AgNPs 的轉(zhuǎn)錄組學與可溶性銀鹽AgNO3誘導作用進行了比較。研究表明，在亞致死濃度AgNPs 作用24 h 可誘導吞噬作用、轉(zhuǎn)運途徑、對氧化應激的響應、谷胱甘肽過氧化物酶活性、對刺激的響應、氧化還原、蛋白水解和氮代謝過程。Hong 等[38]發(fā)現(xiàn)高濃度的吡蟲啉（IMI）主要通過下調(diào)gstmRNA 表達，抑制酶活性和腸道菌群失調(diào)而誘導氧化應激并抑制解毒系統(tǒng)。Jang 等[39]通過微陣列分析驗證了5 nm 的AgNPs 會影響內(nèi)皮和上皮細胞中基因表達的變化，并觀察到在細胞培養(yǎng)初期白細胞介素（IL）-8 和IL-11基因的顯著增長，表明氧化應激相關(guān)基因表達顯著變化，同時也造成了細胞死亡、細胞凋亡和細胞生存相關(guān)基因表達的顯著變化。

由上述結(jié)果顯示，AgNPs 氧化應激作用并非是一個簡單的生物過程，它涉及到微生物的抗藥性、生物大分子損傷和代謝等多方位的生物過程。雖然目前對于氧化應激基因表達和調(diào)控已經(jīng)有很多報道，但是由于細胞應激反應的復雜性，以及傳統(tǒng)的RT-qPCR 或生物芯片技術(shù)的局限性，仍然無法從整體上把握氧化應激對于細胞生長過程和代謝的影響，因此也影響了我們對于NPs 抗菌機理的認識。

4 組學研究氧化應激對微生物的影響

目前，對于AgNPs 抗菌機理大多采用細胞層面和轉(zhuǎn)錄水平的研究方法，然而傳統(tǒng)方法不能夠完全理解微生物及動物細胞的應激反應。高通量測序技術(shù)能夠在全基因組水平實時評估細胞在脅迫下的生長、代謝和應激等反應的轉(zhuǎn)錄調(diào)控（mRNA）和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控（microRNA），從而提供大量的高質(zhì)信息用于功能基因分析。與廣泛研究的哺乳動物細胞或者其它模式生物相比，采用轉(zhuǎn)錄組或者轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控來研究AgNPs 致微生物氧化應激的報道還比較少。

Masri 等[12]運用RNA-seq 技術(shù)對橙皮苷共軛的銀納米顆粒處理的大腸桿菌K1 進行差異基因表達分析，并對細胞應激反應和代謝的基因進行研究。研究得出，納米顆粒的抗菌機制可能與細胞膜破裂和氧化應激有關(guān)，并影響了大腸桿菌K1 中的新陳代謝。此外，在轉(zhuǎn)錄組研究中，鑒定出的轉(zhuǎn)錄物與氧化應激耐受基因有關(guān)，包括那些與超氧化物和過氧化物解毒有關(guān)的基因。這表明當細菌位于生物膜中時，其應對氧化應激的能力對其生存至關(guān)重要。Liu 等[40]使用生態(tài)生物膜模型，評估了幾種變形鏈球菌分離株與鏈球菌和內(nèi)生放線菌的共培養(yǎng)對蔗糖暴露后生物膜組成的影響。研究得出，分離株也可能削弱其在復雜生物膜中競爭的能力，影響健康的生物膜群落向能夠引起疾病的生物膜的發(fā)展。Singh 等[41]通過對1 459 種轉(zhuǎn)錄物的分析發(fā)現(xiàn)，AgNPs 首先影響了金黃色葡萄球菌細菌毒力、抗藥性和代謝（如氨基酸和碳水化合物）基因，而群體感應系統(tǒng)和毒力因子有可能抑制了生物膜的形成。研究表明，甚至是低濃度AgNPs都有可能導致水生系統(tǒng)中細菌生物膜的微擾，并對高等生命產(chǎn)生級聯(lián)效應。Singh 等[42]對于綠膿桿菌生物膜開展了全基因轉(zhuǎn)錄組分析（RNA-Seq），在AgNPs 和Ag+脅迫下各有1 599 和2 458 種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物基因表達有差異，包括生物膜-特異性、趨化反應、群體感應和氧化應激相關(guān)基因等。AgNPs上調(diào)了氧化應激基因，下調(diào)了oxyR、ahpF和trxB基因，其中oxyR基因的降低體現(xiàn)了其氧化應激的提升，另外，代謝基因的分析表明氧化應激還抑制了DNA、RNA、蛋白質(zhì)和糖酵解。另一項研究中，Pan 等[43]運用高質(zhì)量濃度的AgNPs（15 mg/L）對扇形游仆蟲（Euplotes vannus）進行脅迫，結(jié)合RNA-seq、microRNAomic 及生理生化試驗探索相關(guān)的分子機制。研究得出，AgNPs 會引起扇形游仆蟲對ROS 的動態(tài)防御反應，使細胞產(chǎn)生脫毒和修復，顯著的調(diào)控了抗氧化分子和酶的基因諸如：谷胱甘肽合成酶、硫氧還蛋白過氧化物酶、抗氧化蛋白、Gr、GPx、GST、BAX 抑制因子1、SOD、DnaJ 和抗壞血酸過氧化酶。

氧化應激不僅和代謝的基因有關(guān)，其累積還會增強AgNPs 的抗菌活性。Pareek 等[44]使用RNA測序的深層轉(zhuǎn)錄分析來解讀AgNPs 如何發(fā)揮其對多重耐藥性肺炎克雷伯菌抗菌作用。RNA seq數(shù)據(jù)表明，AgNPs 誘導了一種類似三氯生的殺菌機制，該機制可抑制II 型脂肪酸的生物合成。另外，釋放的Ag+在肺炎克雷伯氏菌中在細胞外和細胞內(nèi)均產(chǎn)生氧化應激。

除了轉(zhuǎn)錄組水平研究NPs 的抗菌機理外，近年來蛋白組學也開始逐漸被采用。因為蛋白組學能夠?qū)毎蚪M織中蛋白質(zhì)進行精確評估，這些差異表達或變化可以用作臨床生物標記物（如細胞因子、生長因子和ROS 等），而檢測這些標記物是一種檢測NPs 早期對細胞損害的理想方法，并且通過高通量的方法可以發(fā)掘潛在生物毒性的新的生物標記物[45]。在蛋白組研究中，AgNPs 與含硫蛋白和酶相互作用，導致這些分子的失活。而且，細菌開始產(chǎn)生應激反應，表達一系列的包膜蛋白、熱激蛋白和周質(zhì)蛋白來保護細胞[6]?？紤]到蛋白質(zhì)水平調(diào)控的可能性，以及蛋白質(zhì)酶促活性可能直接導致氧化應激反應中不同菌種間的變異這一事實，F(xiàn)ountain 等[46]利用黃曲霉分離株對氧化應激的特異性蛋白質(zhì)組學分析與黃曲霉毒素生產(chǎn)能力的關(guān)系，并確定潛在的生物標記和宿主抗性育種的目標，鑒定出1 173 種蛋白質(zhì)，差異表達了220種，表明黃曲霉毒素生產(chǎn)水平與氧化應激耐受性和氧化反應活力之間存在相關(guān)性。Pelaez-Soto等[47]進行了蛋白質(zhì)組學分析，鑒定了33 種差異表達的蛋白質(zhì)，得出可可粉提取物（CPEX）對釀酒酵母蛋白質(zhì)表達譜的抗氧化應激（OS）具有保護作用。

5 結(jié)論

AgNPs 具有良好的抗菌效果，因此其產(chǎn)品的開發(fā)應用前景廣闊，然而人們對于AgNPs 抗菌機理的研究尚不充分，因此需對AgNPs 抗菌機理深入研究。由上述研究成果可見，AgNPs 抗菌機理研究涉及到生物膜、細胞損傷和基因表達等過程，而活性氧誘導的氧化應激發(fā)揮了極其重要的作用。本文首先概述了氧化應激的產(chǎn)生，然后從細胞水平闡述了AgNPs 氧化應激對模式菌細胞壁、細胞膜、電子傳遞鏈和解毒酶等影響，從基因和表達水平闡述了氧化應激對關(guān)鍵基因表達、相關(guān)酶類和相關(guān)細胞通路的影響，最后結(jié)合轉(zhuǎn)錄組和蛋白組學綜述了氧化應激對于細胞生長、代謝和應激等反應的轉(zhuǎn)錄調(diào)控和關(guān)聯(lián)蛋白的影響。

雖然上述研究能夠從各自的方面闡述AgNPs的抗菌機制，但是由于氧化應激效應涉及到細胞損傷、基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達的綜合過程，因此如何從基因和表型上全面解析其分子機制有待深入研究。目前還沒有一套完整公認的評價納米產(chǎn)品生物安全性的標準方法和體系，這將給AgNPs 在生物醫(yī)學領(lǐng)域的進一步開發(fā)應用帶來潛在風險，同時大量AgNPs 產(chǎn)品應用可能導致的環(huán)境問題也不容忽視，AgNPs 氧化應激效應研究是納米產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的基礎(chǔ)和保證；各國科學家都呼吁在納米生物醫(yī)療產(chǎn)品被廣泛應用之前，應該對其分子機制進行深入研究，因此闡明AgNPs 對微生物氧化應激作用，并進一步闡明其抗菌機制具有十分重要的意義。