閔倩雯， 周其椿*， 熊 偉， 張顯波， 李建光， 曾 圣， 陳飛雄， 楊 興

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水產(chǎn)研究所， 貴州 貴陽(yáng) 550025； 2.貴州省特種水產(chǎn)工程技術(shù)中心， 貴州 貴陽(yáng) 550025； 3.貴州省水產(chǎn)技術(shù)推廣站， 貴州 貴陽(yáng) 550025)

0 引言

【研究意義】青海湖裸鯉(Gymnocyprisprzewalskii)屬鯉形目鯉科裂腹魚亞科裸鯉屬，俗稱湟魚。因青海湖特殊的地理及水體環(huán)境而使青海湖裸鯉具有無(wú)鱗、耐高寒、耐鹽堿、雜食性的生物學(xué)特性及很強(qiáng)的適應(yīng)能力。其肉質(zhì)細(xì)嫩、鮮美，有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，1964年被水產(chǎn)部列為國(guó)家重要的水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物。近年來(lái)，由于自然和人為的因素影響，青海湖裸鯉資源急劇下降。為保護(hù)青海湖裸鯉種群資源恢復(fù)，多項(xiàng)科學(xué)技術(shù)研究已取得多方面突破。2011年，青海湖裸鯉救護(hù)中心成功完成“青海湖裸鯉淡水全人工養(yǎng)殖技術(shù)研究”項(xiàng)目[1]，為開展引進(jìn)這種高原冷水性魚類積累了技術(shù)資料。對(duì)青海湖裸鯉展開生殖生理學(xué)研究，對(duì)解析其性腺發(fā)育機(jī)制具有重要意義，并可為其人工擴(kuò)繁和分子遺傳育種研究奠定理論基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】Kruppel樣轉(zhuǎn)錄因子(klfs)是一類重要的調(diào)控因子，參與胚胎發(fā)生過(guò)程中的各種生物學(xué)過(guò)程。Klf家族成員的特征是C端鋅指結(jié)構(gòu)為3個(gè)連續(xù)的Cys2/His2結(jié)構(gòu)分別螯合1個(gè)Zn2+組成，其鋅指結(jié)構(gòu)可與DNA分子上的GT盒或CACCC序列結(jié)合發(fā)揮作用[2]。klf2(Kruppel-like factor-2)是Kruppel家族的重要成員，可參與多種細(xì)胞增殖、分化調(diào)控；不僅廣泛表達(dá)于血管內(nèi)皮[3]，還表達(dá)于心[4]、肝[5]、腎[6]等重要器官，在各種生理和炎癥性疾病及其發(fā)病機(jī)制中也起著重要的調(diào)節(jié)作用[7-8]。JHA等[8-9]研究表明，klf2缺陷型小鼠于產(chǎn)前階段死亡，表明klf2基因在胚胎發(fā)育過(guò)程中的關(guān)鍵作用。然而，klf2基因在裸鯉中的功能和作用還未見研究報(bào)道。【研究切入點(diǎn)】圍繞青海湖裸鯉卵巢中klf2基因的克隆和功能開展相關(guān)研究。以青海湖裸鯉為研究對(duì)象，克隆klf2 cDNA全長(zhǎng)序列；基于多物種klf2基因的氨基酸序列，應(yīng)用生物信息學(xué)方法比較分析klf2基因的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，利用RT-PC和realtime-QPCR檢測(cè)青海湖裸鯉各組織klf2基因的表達(dá)情況?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】首次克隆出青海湖裸鯉klf2 cDNA全長(zhǎng)序列，多物種比對(duì)構(gòu)建裸鯉klf2基因的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。分析裸鯉klf2基因在各組織分布表達(dá)情況，以及對(duì)于klf2基因在裸鯉性腺中存在的雌雄差異表達(dá)，以得出klf2基因在裸鯉卵巢發(fā)育過(guò)程中可能的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)魚

青海湖裸鯉從青海湖裸鯉救護(hù)中心引進(jìn)，在貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所試驗(yàn)基地培育，于自然光周期下在22℃的恒溫循環(huán)水系統(tǒng)中飼養(yǎng)。投喂?jié)h業(yè)飼料，早中晚各1次。

1.2 青海湖裸鯉klf2基因克隆

根據(jù)GenBank中報(bào)道的相關(guān)物種klf2的基因序列，在基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)合成簡(jiǎn)并引物，對(duì)klf2部分基因片段擴(kuò)增及測(cè)序，獲取青海湖裸鯉klf2基因中間部分序列，并通過(guò)5′-和3′-RACE(Rapid-amplifiction of cDNA ends)測(cè)序驗(yàn)證及序列比對(duì)獲取klf2基因全序列。

1.3 klf2基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

從NCBI的GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載包括人在內(nèi)的14個(gè)物種klf2基因氨基酸序列(表1)，對(duì)14個(gè)不同物種及克隆的青海湖裸鯉的klf2氨基酸序列，應(yīng)用MEGA 6.0以NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。斑馬魚klf17(NP_571798.1)氨基酸序列作為外類群。

表1 不同物種klf2 基因氨基酸序列

1.4 脊椎動(dòng)物klf2 基因共線性分析

在Ensembl Genome Browser(http://www.ensembl.org)分析構(gòu)建脊椎動(dòng)物klf2基因及其相鄰基因圖譜研究。

1.5 青海湖裸鯉klf2 基因組織表達(dá)模式分析

解剖24月齡裸鯉，取腦等11個(gè)組織于液氮速凍。按照RNAiso Plus操作說(shuō)明提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用基因特異引物擴(kuò)增，檢驗(yàn)klf2基因在各組織中的分布情況。

1.6 青海湖裸鯉klf2 基因在各時(shí)期卵巢中的表達(dá)

取3月齡、6月齡、9月齡、12月齡、18月齡及24月齡的青海湖裸鯉卵巢液氮速凍，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用Real-time PCR檢測(cè)klf2基因在各時(shí)期裸鯉卵巢中的表達(dá)情況。管家基因β-actin作為內(nèi)參，目標(biāo)基因mRNA的相對(duì)表達(dá)水平采用公式R=2-△△Ct方法計(jì)算[10]，結(jié)果表示為Ct值的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(Mean±SD)，應(yīng)用SPSS進(jìn)行差異顯著性分析，顯著性水平P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 青海湖裸鯉klf2 cDNA和氨基酸全序列

基于RT-PCR和RACE分析顯示，青海湖裸鯉klf2全長(zhǎng)cDNA序列為2 183 bp，包括5′端249 bp的非編碼區(qū)，1 104 bp的蛋白質(zhì)編碼區(qū)和3′端830 bp非編碼區(qū)；開放閱讀框編碼367個(gè)氨基酸(圖1)。

圖1 青海湖裸鯉 klf2 cDNA全序列及推導(dǎo)的氨基酸序列

2.2 脊椎動(dòng)物klf2 基因序列對(duì)比及系統(tǒng)進(jìn)化聚類結(jié)果

通過(guò)氨基酸序列比對(duì)，klf2基因在脊椎動(dòng)物間有高度相似性，具有保守的zf-H2C2_2結(jié)構(gòu)域。從圖2看出，克隆的青海湖裸鯉klf2與人、小鼠、雞、蜥蜴、爪蟾、腔棘魚、斑點(diǎn)雀鱔、紅鰭東方鲀、青鳉、羅非魚、斑馬魚、金魚、金線鲃、鯉魚klf2基因間的氨基酸序列相似性分別為49.8%、49.5%、58.1%、47.0%、59.8%、58.5%、70.9%、68.4%、67.7%、68.5%、85.6%、91.3%、95.1%、93.5%。

圖2 脊椎動(dòng)物klf2氨基酸序列比對(duì)

根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果(圖3)，四足類、人、小鼠、蜥蜴的klf2基因氨基酸序列聚為一支；雞、爪蟾、腔棘魚的klf2基因氨基酸序列聚為一支；魚類紅鰭東方鲀、青鳉、羅非魚、斑點(diǎn)雀鱔、金魚、鯉魚、斑馬魚、金線鲃、青海湖裸鯉的klf2基因蛋白序列聚為一支。

圖3 基于氨基酸序列的klf2系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 脊椎動(dòng)物klf2基因的共線性

共線性分析結(jié)果(圖4)顯示，klf2基因與其鄰近基因eps15l1、calr3、ap1m1、tpm4在人、小鼠、雞、蜥蜴中的共線性高度保守，與爪蟾的calr3、ap1m1、tpm4不共線；在部分魚類中，klf2基因與其鄰近基因eps15l1、calr3、ap1m1、tpm4高度保守；與腔棘魚的ap1m1、tpm4不共線；與斑點(diǎn)雀鱔、羅非魚和金線鲃tpm4不共線。

圖4 脊椎動(dòng)物 klf2基因共線性

2.4 青海湖裸鯉klf2 組織表達(dá)模式

RT-PCR分析結(jié)果(圖5)表明，青海湖裸鯉klf2基因在成魚各組織中表達(dá)存在雌雄差異，雌性個(gè)體中klf2基因高量表達(dá)于卵巢，且在垂體、鰓、心臟、脾臟中存在中量表達(dá)，在頭腎、腎中存在微量表達(dá)；雄性個(gè)體中klf2基因在垂體、鰓、心臟、脾臟、頭腎、腎中存在微量表達(dá)。

圖5 青海湖裸鯉klf2 基因組織表達(dá)模式

2.5 青海湖裸鯉 klf2基因在卵巢不同發(fā)育階段的表達(dá)

Real-time PCR分析(圖6)發(fā)現(xiàn)，klf2在3月齡、6月齡、9月齡、12月齡、18月齡及24月齡卵巢中均存在表達(dá)，隨月齡增大klf2的相對(duì)表達(dá)量呈增加趨勢(shì)，表現(xiàn)為3月齡<6月齡<9月齡<12月齡<18月齡<24月齡，其中，3月齡表達(dá)量顯著低于其余處理；在6月齡、9月齡和12月齡持續(xù)顯著升高，后期持續(xù)高量表達(dá)。

圖6 青海湖裸鯉 klf2基因在卵巢不同發(fā)育>階段的表達(dá)水平

3 討論

研究成功克隆了青海湖裸鯉klf2基因，克隆的klf2基因具有保守的zf-H2C2_2結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，以斑馬魚klf17作為外類群，克隆的klf2基因與其他脊椎動(dòng)物的klf2聚為一支，且klf2基因序列同源性最低為47.0%，最高達(dá)95.1%。共線性分析顯示，四足類和魚類klf2基因及相鄰基因的共線性較為保守。

klf2作為轉(zhuǎn)錄因子，在生物的多種信號(hào)通路和器官發(fā)育中其重要作用。研究結(jié)果顯示，klf2在檢測(cè)的青海湖裸鯉的多個(gè)組織中有表達(dá)，說(shuō)明該基因的功能是多元化的。研究首次在魚類卵巢中對(duì)該基因的表達(dá)功能研究發(fā)現(xiàn)，klf2在整個(gè)青海湖裸鯉卵巢發(fā)育后期表達(dá)持續(xù)升高，并在性成熟的卵巢保持較高水平的表達(dá)，3月齡雌性青海湖裸鯉卵巢開始進(jìn)行減數(shù)分裂，一般人工養(yǎng)殖條件下24月齡能夠達(dá)到性成熟。從卵巢減數(shù)分裂起始至卵巢發(fā)育成熟，klf2都存在持續(xù)升高的表達(dá)，說(shuō)明魚類klf2可能在卵巢發(fā)育過(guò)程和卵子發(fā)生過(guò)程都扮演重要角色，但其具體功能和作用機(jī)制，還有待進(jìn)一步研究。貴州省冷水資源量巨大，水質(zhì)良好，水溫常年穩(wěn)定在11～25℃，適宜養(yǎng)殖高品質(zhì)冷水性魚類，十分適宜青海湖裸鯉產(chǎn)業(yè)發(fā)展。研究結(jié)果為進(jìn)一步了解klf2基因的作用和機(jī)理提供了基礎(chǔ)信息，同時(shí)為青海湖裸鯉的人工繁殖和遺傳育種提供了理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

采用cDNA末端快速擴(kuò)增法首次克隆獲得青海湖裸鯉klf2基因全長(zhǎng)cDNA序列，克隆的klf2基因具有保守的zf-H2C2_2結(jié)構(gòu)域；其與其他脊椎動(dòng)物的klf2基因聚為一支，四足類和魚類klf2基因及相鄰基因的共線性較為保守。采用生物信息學(xué)對(duì)該基因及其編碼蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)分析,并采用RT-PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)出青海湖裸鯉各組織klf2基因的差異表達(dá)。生物信息學(xué)及表達(dá)研究分析表明，klf2基因可能在青海湖裸鯉的卵巢發(fā)育和卵子發(fā)生過(guò)程起重要作用。研究結(jié)果將為進(jìn)一步開展klf2基因在青海湖裸鯉卵巢發(fā)育的分子調(diào)節(jié)機(jī)理研究中應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。