李翠娟 唐 穎 彭翠蘭 慕麗娜 楊 雪 王春波 李 佳 王琳琳

(黑龍江省大慶龍南醫(yī)院呼吸內(nèi)科，大慶市 163453，電子郵箱：juanli085338@163.com)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)以不完全可逆的氣流受限為特征，反復(fù)發(fā)作的急性加重會(huì)加劇氣流受限，最終引起呼吸衰竭甚至死亡。目前，臨床上主要通過(guò)藥物、無(wú)創(chuàng)機(jī)械通氣、有氧運(yùn)動(dòng)等方法治療穩(wěn)定期COPD，以預(yù)防急性加重的發(fā)作，減輕氣流受限，進(jìn)而提高患者的生活質(zhì)量、延長(zhǎng)生存時(shí)間。在治療穩(wěn)定期COPD患者過(guò)程中，準(zhǔn)確評(píng)估病情、及時(shí)發(fā)現(xiàn)具有較高急性加重和死亡風(fēng)險(xiǎn)的患者，對(duì)更好地制定診療方案有重要意義。

氣道炎癥反應(yīng)的持續(xù)存在在COPD發(fā)病中起重要作用，多項(xiàng)研究表明腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6、IL-8、IL-18等促炎細(xì)胞因子的大量分泌與COPD的發(fā)病有關(guān)[1-3]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，微小RNA(microRNA，miRNA)能夠在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)炎癥基因的表達(dá)，其中miRNA-181a具有抑制炎癥作用，可抑制香煙提取物誘導(dǎo)大鼠肺泡巨噬細(xì)胞釋放TNF-α、IL-6、IL-8[4]。而臨床研究顯示穩(wěn)定期COPD患者體內(nèi)miRNA-181a的表達(dá)明顯減少[5]。低表達(dá)的miRNA-181a是否與COPD的炎癥激活、COPD的預(yù)后有關(guān)，目前尚未清楚。本研究探討穩(wěn)定期COPD患者外周血miRNA-181a表達(dá)情況，及其與預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年9月至2019年7月在我院就診的300例穩(wěn)定期COPD患者作為COPD組，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合穩(wěn)定期COPD的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；(2)近8周臨床癥狀穩(wěn)定；(3)隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并呼吸道感染或正在使用抗生素治療者；(2)合并肺癌、肺結(jié)核等其他呼吸系統(tǒng)疾病者；(3)合并自身免疫性疾病、惡性腫瘤等患者。另選取同期體檢的150例健康志愿者作為對(duì)照組，兩組一般資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，見(jiàn)表1。

表1 兩組一般資料的比較

1.2 研究方法

1.2.1 外周血miRNA-181a表達(dá)的檢測(cè)：采集COPD組患者入院后次日及對(duì)照組志愿者體檢當(dāng)日的空腹靜脈血3～5 mL，采用miRNA提取分離試劑盒(北京天根生化科技公司，批號(hào)：DP503)分離miRNA，然后采用miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒(北京天根生化科技公司，批號(hào)：KR201)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到miRNA對(duì)應(yīng)的cDNA。采用熒光定量檢測(cè)試劑盒(北京天根生化科技公司，批號(hào)：FP401)進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)，以U6為內(nèi)參基因，按試劑盒說(shuō)明書(shū)配置PCR的反應(yīng)體系，包括cDNA 2 μL熒光定量檢測(cè)試劑盒內(nèi)的預(yù)混液10 μL、10 μmol/L的上下游引物各0.4 μL、去離子水補(bǔ)足至20.0 μL。于熒光定量PCR儀(Bio-Rad公司)完成PCR，反應(yīng)條件為95℃ 15 min后94℃ 20 s、60℃ 34 s(重復(fù)40個(gè)循環(huán))。按照2-ΔΔCt計(jì)算miRNA-181a的表達(dá)量。

1.2.2 血清促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18水平的檢測(cè)：采集COPD組患者入院后次日及對(duì)照組志愿者體檢當(dāng)日的空腹靜脈血5～6 mL，采用酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒(上海西唐公司，批號(hào)：F00024、F00019、F00142、F00242、F00137)檢測(cè)TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18的水平，均按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)操作。

1.2.3 預(yù)后隨訪：隨訪時(shí)間為入組當(dāng)天至2020年7月31日，共12～46個(gè)月，隨訪方式為每個(gè)月進(jìn)行門診復(fù)查或電話回訪。隨訪的重點(diǎn)事件包括第一次發(fā)生急性加重、全因死亡。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以(x±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；預(yù)后影響因素的分析采用Cox回歸模型。采用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行Pearson檢驗(yàn)、Kaplan-Meier曲線的繪制以及l(fā)og-rank檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 COPD組與對(duì)照組miRNA-181a相對(duì)表達(dá)量和細(xì)胞因子水平的比較 與對(duì)照組比較，COPD組患者外周血miRNA-181a的相對(duì)表達(dá)量降低，血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18水平升高(均P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 兩組miRNA-181a相對(duì)表達(dá)量和細(xì)胞因子水平的比較

2.2 COPD患者外周血miRNA-181a表達(dá)量與TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18水平的相關(guān)性 COPD患者外周血miRNA-181a的表達(dá)量與血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18水平呈負(fù)相關(guān)(均P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 COPD患者外周血miRNA-181a表達(dá)量與TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18水平的相關(guān)性

2.3 隨訪期間不同miRNA-181a、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18水平的COPD患者首次急性加重的發(fā)生情況 根據(jù)COPD患者miRNA-181a、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18的中位數(shù)將其分為miRNA-181a高表達(dá)組與低表達(dá)組、細(xì)胞因子高水平組與低水平組。繪制Kaplan-Meier曲線并行l(wèi)og-rank檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，與miRNA-181a低表達(dá)患者比較，miRNA-181a高表達(dá)患者的急性加重累積發(fā)生率降低(P<0.05)；與TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18低水平患者比較，TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18高水平患者的急性加重累積發(fā)生率相應(yīng)增高(均P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 COPD組不同水平miRNA-181a、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18患者急性加重情況的Kaplan-Meier曲線

2.4 隨訪期間不同miRNA-181a、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18水平的COPD患者的死亡情況 繪制Kaplan-Meier曲線并行l(wèi)og-rank檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，與miRNA-181a低水平患者比較，miRNA-181a高水平患者的累積病死率降低(P<0.05)；與TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18低水平患者比較，TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18高水平患者的累積病死率相應(yīng)增高(均P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 不同miRNA-181a、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18水平COPD患者死亡情況的Kaplan-Meier曲線

2.5 COPD患者發(fā)生急性加重影響因素的Cox回歸分析 以COPD患者發(fā)生急性加重情況為應(yīng)變量(未發(fā)生急性加重=0，發(fā)生急性加重=1)，以miRNA-181a、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18為自變量(以實(shí)際測(cè)得值進(jìn)入模型)，進(jìn)行Cox回歸分析。結(jié)果顯示miRNA-181a表達(dá)量、TNF-α和IL-6水平是COPD患者發(fā)生急性加重的影響因素(均P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 COPD患者發(fā)生急性加重影響因素的Cox回歸分析

2.6 COPD患者死亡影響因素的Cox回歸分析 以COPD組患者死亡情況為應(yīng)變量(存活=0，死亡=1)，以miRNA-181a、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18為自變量(以實(shí)際測(cè)得值進(jìn)入模型)，進(jìn)行Cox回歸分析。結(jié)果顯示miRNA-181a表達(dá)量、IL-6和IL-18水平是COPD患者死亡的影響因素(均P<0.05)，見(jiàn)表5。

表5 COPD患者死亡影響因素的Cox回歸分析

3 討 論

COPD具有反復(fù)發(fā)作的特點(diǎn)，可導(dǎo)致氣道重塑及氣流不可逆受限加重，最終發(fā)展為呼吸衰竭、肺源性心臟病及死亡。準(zhǔn)確評(píng)估COPD病情、預(yù)測(cè)可能發(fā)生急性加重的高?；颊?，對(duì)制定診療方案具有積極意義，從而有助于改善COPD患者生活質(zhì)量、延長(zhǎng)生存時(shí)間、降低死亡率。肺功能測(cè)定、COPD評(píng)估測(cè)試評(píng)分是目前評(píng)價(jià)COPD病情的主要方法，但肺功能測(cè)定存在測(cè)定步驟復(fù)雜、需要重復(fù)多次檢查、可操作性不強(qiáng)等缺點(diǎn)，COPD評(píng)估測(cè)試評(píng)分具有受主觀判斷影響較大的不足，用于評(píng)估遠(yuǎn)期預(yù)后的價(jià)值有限。

miRNA能夠在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)并具有廣泛的生物學(xué)作用。多項(xiàng)研究顯示，COPD患者外周血中存在多種miRNA的表達(dá)，且對(duì)病情及預(yù)后具有一定的評(píng)估價(jià)值[5,7-8]。氣道慢性炎癥反應(yīng)是COPD的基本病理生理特征，而TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18等促炎細(xì)胞因子生成增多在COPD的氣道炎癥中起重要作用[1-3,9-11]。研究顯示，miRNA-181a可以抑制炎癥，miRNA-181a的低表達(dá)與COPD的發(fā)生有關(guān)[4-5]。本研究結(jié)果顯示COPD患者血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18水平增加，外周血miRNA-181a表達(dá)量減少，且COPD患者外周血miRNA-181a的表達(dá)量與血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18的水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，提示在COPD的穩(wěn)定期，miRNA-181a呈低表達(dá)，并可以負(fù)調(diào)控多種促炎因子，進(jìn)而介導(dǎo)氣道炎癥、引起氣流受限。

隨著氣流受限的加重，COPD患者出現(xiàn)病情急性加重甚至死亡[12]。多項(xiàng)研究顯示，TNF-α、IL-1β、IL-18、細(xì)胞間黏附分子1等炎癥指標(biāo)對(duì)COPD患者的預(yù)后具有評(píng)估價(jià)值[13-15]。但COPD氣道炎癥的激活涉及復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，COPD患者體內(nèi)起促炎作用的細(xì)胞因子可能存在個(gè)體差異，單純根據(jù)一種或幾種促炎細(xì)胞因子對(duì)患者的病情進(jìn)行預(yù)后評(píng)估具有一定的局限性。miRNA-181a作為炎癥反應(yīng)的上游調(diào)控分子，同時(shí)參與多種促炎因子的調(diào)控，其在病情及預(yù)后的評(píng)估中可能有一定的價(jià)值。本研究結(jié)果顯示miRNA-181a低表達(dá)與穩(wěn)定期COPD患者急性加重累積發(fā)生率、累積病死率更高；進(jìn)一步的Cox回歸分析結(jié)果顯示，miRNA-181a、TNF-α、IL-6是穩(wěn)定期COPD患者發(fā)生急性加重的影響因素，而miRNA-181a、IL-6、IL-18是穩(wěn)定期COPD患者死亡的影響因素。提示miRNA-181a低表達(dá)是穩(wěn)定期COPD患者不佳的危險(xiǎn)因素，miRNA-181a或有助于評(píng)估穩(wěn)定期COPD患者的預(yù)后。

綜上所述，穩(wěn)定期COPD患者miRNA-181a表達(dá)降低，且與促炎細(xì)胞水平TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18水平呈負(fù)相關(guān)。miRNA-181a表達(dá)降低是穩(wěn)定期COPD患者發(fā)生急性加重或死亡的危險(xiǎn)因素。但本研究為單中心研究且隨訪時(shí)間較短，今后將延長(zhǎng)隨訪時(shí)間、進(jìn)行多中心研究驗(yàn)證結(jié)果。