陳 雪 張嫄怡 李品玉 楊 堅 段文彪

(肇慶醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校1 病理學(xué)與病理生理學(xué)教研室，2 學(xué)校辦公室，廣東省肇慶市 526020，電子郵箱：chenxuegd@qq.com)

糖尿病是一組以高血糖為特征的代謝性疾病，是由于胰島素分泌缺陷或其生物作用受損，或兩者兼有引起糖、脂肪、蛋白質(zhì)代謝紊亂為主要特征的慢性代謝性疾病，可導(dǎo)致多系統(tǒng)功能損害，出現(xiàn)眼、腎、神經(jīng)、心臟、血管等組織及器官的慢性進行性病變、功能減退甚至衰竭。隨著我國經(jīng)濟的高速發(fā)展，人們生活方式的改變以及人口老齡化的到來，糖尿病發(fā)病率逐年升高，已經(jīng)嚴重威脅到人們的健康與生命。根據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟報告顯示，2019年全球約有4.63億成人患有糖尿病，而中國的糖尿病患者數(shù)量為1.164億[1]。當(dāng)糖尿病患者沒有得到充分的醫(yī)療支持時，將面臨嚴重的并發(fā)癥患病風(fēng)險，如心腦血管疾病、失明、腎功能衰竭等，這嚴重影響患者的生活質(zhì)量，增加其醫(yī)療費用，加重家庭負擔(dān)。糖尿病所引起的腎功能損害是糖尿病的嚴重并發(fā)癥之一，也是糖尿病致死的主要原因。二苯乙烯苷(2,3,5,4′-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glycoside，TSG)是中藥何首烏中主要的水溶性生物活性成分，具有降血脂、抗炎、抗氧化、抗動脈血管硬化、抗衰老和神經(jīng)保護等作用[2]。本研究觀察TSG對血糖波動性糖尿病小鼠血糖、血脂及腎臟功能的影響，探討TSG對血糖波動性糖尿病小鼠腎臟的保護作用，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取45只健康雄性昆明小鼠，體重25～30 g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，許可證號：SCXK(粵)2018-0002，飼養(yǎng)環(huán)境濕度及溫度適宜，12 h晝夜交替，標準飼料喂養(yǎng)，自由進食和飲水。

1.2 實驗分組、模型制備與干預(yù)方法 將45只雄性小鼠按隨機數(shù)字表分為正常對照組(A組)10只，正常血糖波動TSG治療組(B組)10例和糖尿病模型組25只，給予糖尿病模型組25只小鼠禁食12 h后，清晨空腹左下腹腔內(nèi)注射60 mg/kg的鏈脲佐菌素(北京索萊寶科技有限公司，批號：917G031)，72 h后取尾靜脈血檢測血糖，隨機血糖≥16.7 mmol/L則視為糖尿病小鼠模型造模成功，本研究造模成功率為92%(23/25)；將造模成功的糖尿病模型組小鼠按隨機數(shù)字表分為血糖波動性糖尿病組(C組)10只、血糖波動性糖尿病TSG治療組(D組)10只,剩余其他小鼠交由實驗動物中心處理。以糖尿病小鼠模型造模成功當(dāng)天作為實驗開始，B組、C組、D組小鼠給予腹腔注射2 g/kg葡萄糖，2次/d，分別于每日08：00與14：00進行注射，C組、D組小鼠在腹腔注射葡萄糖30 min后皮下注射普通胰島素1～3U，造成血糖波動。給予B組、D組小鼠50 mg/kg TSG(上海士鋒生物科技有限公司，批號：178031025)灌胃，2次/d，分別于每日09：00及17：00給藥，連續(xù)干預(yù)8周。A組大鼠于同時間段給予等量生理鹽水灌胃。

1.3 觀察指標 (1)一般情況：實驗開始后，每天觀察各組小鼠的一般情況，包括精神狀態(tài)、活動情況、飲食、大小便、毛發(fā)等，每周稱體重1次。(2)血糖監(jiān)測及血糖波動性：實驗開始后，每周進行1次7個時間點(同一天)的血糖檢測，時間分別是08：00、08：30、10:00、14：00，14：30、16：00、20：00，共測量8周。取小鼠尾靜脈血，采用羅氏血糖儀及配套試紙進行血糖測定，記錄血糖數(shù)據(jù)，計算各組小鼠即日內(nèi)血糖波動評估參數(shù)，包括平均血糖(mean blood glucose,MBG)水平、血糖水平標準差(standard deviation of blood glucose,SDBG)、最大血糖波動幅度(largest amplitude of glycemic excursions,LAGE)；MBG反映血糖平均水平；SDBG反映血糖離散程度，SDBG離平均值越遠，離散程度就越大，表示血糖波動越大；LAGE即日內(nèi)血糖最高值與最低值，LAGE越大，血糖波動幅度就越大。比較各組小鼠干預(yù)8周后的MBG、SDBG、LAGE。(3)肝腎功能：干預(yù)8周后，各組小鼠禁食10 h，自由飲水，終點當(dāng)日8：00～10：00之間稱重后，采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，取尾靜脈血采用葡萄糖氧化酶法檢測空腹血糖；心臟取血1 mL，3 000 r/min離心5 min分離血清標本備用，采用高效液相離子交換色譜法檢測糖化血紅蛋白(hemoglobin A1c，HbA1c)的含量，采用全自動生化分析儀測定總膽固醇、三酰甘油、血肌酐、血尿素氮的含量。其中，糖化血紅蛋白試劑盒購自上海伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司(批號：740)，總膽固醇試劑盒購自北京普利萊生物技術(shù)公司(批號：E1005),三酰甘油試劑盒購自北京普利萊生物技術(shù)公司(批號：E1003)，血肌酐試劑盒購自南京建成生物工程研究所(批號：C011-2-1)，血尿素氮試劑盒購自南京建成生物工程研究所(批號：C013-2-1)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料用均數(shù)±標準差(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 4組小鼠一般情況的比較 干預(yù)8周后，A組、B組小鼠反應(yīng)敏捷，精神狀態(tài)佳，毛發(fā)白亮且有光澤，攝食量、攝水量及尿量均正常；C組、D組小鼠消瘦，毛發(fā)粗糙且無光澤，有脫落，活動減少，動作遲緩，精神萎靡，出現(xiàn)“三多一少”(多飲多食多尿，體重減輕)的糖尿病表現(xiàn)。

2.2 4組小鼠體重及血糖變化的比較 干預(yù)8周后，4組小鼠的體重、空腹血糖、MBG、SDBG及LAGE比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，其中C組與D組小鼠的體重均低于A組與B組，空腹血糖、MBG、SDBG及LAGE均高于A組與B組，且C組的空腹血糖、MBG、SDBG及LAGE均高于D組(均P<0.05)；而C組與D組、A組與B組之間的體重比較，以及A組與B組之間的空腹血糖、MBG、SDBG及LAGE比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見表1。

表1 4組小鼠體重及血糖變化的比較(x±s)

2.3 4組小鼠血脂及腎功能指標的比較 干預(yù)8周后，4組小鼠的血清HbA1c、總膽固醇、三酰甘油、血肌酐、血尿素氮水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，其中C組與D組小鼠的上述指標水平均高于A組與B組，且C組的血清總膽固醇、三酰甘油、血肌酐、血尿素氮水平均高于D組(均P<0.05)；而C組與D組之間的血清HbA1c水平比較，以及A組與B組之間的血清HbA1c、總膽固醇、三酰甘油、血肌酐、血尿素氮水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。見表2。

表2 4組小鼠血脂及腎功能指標的比較(x±s)

3 討 論

糖尿病常見的并發(fā)癥有多發(fā)性神經(jīng)炎、失明、肢體壞疽、腎衰竭等，持續(xù)性的慢性高血糖是引起糖尿病慢性并發(fā)癥的關(guān)鍵因素[3]。動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，在高糖、高脂及腹腔注射STZ誘導(dǎo)的糖尿病動物模型中，交替注射葡萄糖及胰島素引起的血糖波動可導(dǎo)致腎功能損傷[4]。在臨床上，血糖波動性糖尿病比持續(xù)性高血糖糖尿病患者更為多見，且血糖波動性糖尿病對機體的危害更大[5]。本研究結(jié)果顯示，干預(yù)8周后C組、D組小鼠的體重輕于A組、B組(P<0.05)，且出現(xiàn)多食、多飲、多尿等現(xiàn)象，提示血糖波動性糖尿病小鼠造模成功。本研究結(jié)果還顯示，干預(yù)8周后C組與D組的空腹血糖、MBG、SDBG、LAGE，以及血清HbA1c、總膽固醇、三酰甘油、血肌酐、血尿素氮水平均高于A組與B組(均P<0.05)，說明血糖波動越大，小鼠的腎功能損傷就越嚴重。

TSG是何首烏中主要的水溶性生物活性有效成分，具有降血脂、抗炎、抗氧化、抗動脈血管硬化、抗衰老和神經(jīng)保護、腎臟保護等作用[6]。本研究結(jié)果顯示，C組的血清總膽固醇、三酰甘油水平均高于D組(均P<0.05)，這說明TSG對血糖波動性糖尿病小鼠的血脂具有調(diào)節(jié)作用?？赡茉蚴荰SG可抑制內(nèi)源性三酰甘油的合成，改善脂質(zhì)在體內(nèi)分布以及在內(nèi)臟器官的沉積，提高肝細胞內(nèi)脂蛋白脂肪酶、肝脂酶的活性，加速三酰甘油的分解，從而減少肝細胞內(nèi)三酰甘油的堆積[7]。

有研究發(fā)現(xiàn)，在糖化血紅蛋白水平相近的患者中，血糖波動較大者的慢性并發(fā)癥發(fā)病率和危害性更高，血糖波動被視為糖尿病心血管并發(fā)癥的預(yù)測因子[8]。本研究結(jié)果顯示，C組與D組小鼠的血清HbA1c水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)，但C組的空腹血糖、MBG、SDBG及LAGE均高于D組(均P<0.05)。與相關(guān)研究結(jié)果相似[9]。這表明TSG不僅有降血脂的作用，還可改善糖尿病小鼠的胰島素抵抗[10]。研究表明，血糖波動可能引起染色體重構(gòu)、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激增強[10]，因此，在糖尿病的治療中，不能完全依賴HbA1c水平來評估療效，更要關(guān)注血糖波動的情況。

糖尿病患者出現(xiàn)長期的高血糖波動，會使動脈及毛細血管發(fā)生不同程度的病變與損傷，特別是腦和腎臟的血管，且糖尿病最常見的并發(fā)癥之一是腎功能損傷。研究發(fā)現(xiàn)，血糖波動可促進糖尿病慢性腎功能損傷的發(fā)生發(fā)展，血糖波動越大，糖尿病腎病發(fā)生率越高[11]。本研究結(jié)果顯示，C組與D組小鼠的血清肌酐、尿素氮水平均高于A組與B組，且C組的血清肌酐、尿素氮水平均高于D組(均P<0.05)，表明長期的血糖波動會導(dǎo)致糖尿病小鼠腎功能受損，引起血清肌酐與尿素氮水平升高。原因可能是糖尿病患者血糖波動會引起氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、血管內(nèi)皮細胞損傷、胰島B細胞功能缺陷及胰島素抵抗、凝血機制活化[12]，長期的血糖波動還會增加氧化應(yīng)激，氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡，產(chǎn)生的活性氧物質(zhì)可引起炎癥細胞的招募，促進炎癥介質(zhì)的釋放，引起慢性的炎癥反應(yīng)，從而加重腎的損傷[13]。給予TSG干預(yù)后，血糖波動性糖尿病小鼠的腎功能損傷減輕，說明TSG對血糖波動性糖尿病小鼠的腎功能有一定的保護作用。原因可能是TSG具有強大的抗氧化作用，可以減少超氧化自由基的損傷，有效改善糖尿病小鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激指標，逆轉(zhuǎn)糖尿病小鼠體內(nèi)的氧化與抗氧化失平衡，減輕氧化應(yīng)激的損傷程度[14]。張園等[15]研究發(fā)現(xiàn)，TSG對2型糖尿病大鼠具有抗炎、抗氧化作用，而且能抑制主動脈的細胞凋亡相關(guān)基因核因子κB的表達。還有研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇聯(lián)合TSG可能通過抗腎臟衰老，延緩糖尿病腎病的進展，TSG可通過減少脂質(zhì)的過氧化反應(yīng)，減弱超氧自由基對血管內(nèi)皮細胞的損傷作用，從而在一定程度上防治糖尿病腎病[13]。

綜上所述，TSG可降低血糖波動性糖尿病小鼠的血糖與血脂水平，保護其腎臟功能。目前TSG對糖尿病腎損傷的保護作用主要集中于降血脂、抗氧化應(yīng)激方面的研究，下一步應(yīng)探索TSG在糖尿病腎損傷中保護作用的分子機制，為糖尿病的預(yù)防及治療提供新的理論依據(jù)。