余 平 李葉子 萬少兵

(湖北省武漢市第三醫(yī)院急診科，武漢市 430060，電子郵箱：y94eay@163.com)

心肌纖維化又稱心肌鈣化，是由心臟代謝異常、心肌缺血以及冠狀動脈硬化等多種因素引起的一種疾病，呈持續(xù)性或反復加重，可逐漸發(fā)展為心力衰竭，即慢性缺血性心臟病[1-2]。同型半胱氨酸(homocysteine，Hcy)水平升高是發(fā)生心肌纖維化的重要原因之一，其可以直接或間接導致血管內(nèi)皮細胞損傷，增強血小板功能，從而促進血栓形成[3-4]。故本實驗使用Hcy誘導CF以建立心肌纖維化細胞模型。沉默信息調(diào)節(jié)因子(sirtuin，SIRT)1為哺乳動物SIRT家族成員之一，可以使多個蛋白質(zhì)去乙?；淖兤浠钚?，通過調(diào)節(jié)SIRT1可以調(diào)控細胞能量代謝、氧化應激等多種生物作用[5]。p53蛋白的主要作用包括阻滯細胞周期、促進細胞凋亡等[6]。有研究表明，SIRT1可通過將p53蛋白的第382位賴氨酸殘基乙?；档蚿53蛋白與DNA順式元件的結(jié)合能力，從而抑制細胞凋亡[7]。本實驗旨在研究抑制SIRT1/p53通路對Hcy誘導的心肌纖維化的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞和試劑 心肌成纖維細胞(cardiac fibroblasts,CF)購于中科院上海細胞庫(批號：234015)；Hcy購自武漢博士德生物工程有限公司(批號：780346)；SIRT1/p53通路抑制劑EX527購自北京四季青生物科技有限責任公司(批號：2220216)；杜氏改良伊戈爾培養(yǎng)基(Dulbecco′s modified Eagle medium,DMEM)、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶購于美國Abcam公司(批號：10247、55930、77380)；細胞計數(shù)檢測(cell counting kit-8,CCK-8)試劑盒購于北京鼎國科技有限公司(批號：2300089)；膜聯(lián)蛋白Ⅴ(Annexin Ⅴ)-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)/碘化丙啶(propidium iodide,PI)試劑盒購于天津百賽斯生物科技有限公司(批號：1113076)；TRIzol試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ購于日本TaKaRa公司(批號：2340754、3476208、2502179)；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)引物購于上海生工生物工程股份有限公司(批號：7990376)；二喹啉甲酸試劑盒、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)凝膠配置試劑盒、聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)購于上海碧云天生物技術(shù)研究所(批號：31349、20169、1154269)；SIRT1抗體、乙?；痯53(acetylated p53,Ac-p53)抗體、Ⅰ型膠原α1鏈(collagen type Ⅰ alpha 1 chain,COL1A1)抗體、Ⅲ型膠原α1鏈(collagen type Ⅲ alpha 1 chain,COL3A1)抗體、肌動蛋白α2(actin alpha 2,Acta2)抗體、β-肌動蛋白(β-actin)抗體購于美國Santa Cruz公司(批號：33345670、36309270、32013452、340983457、22456983、55309718)；二抗購于美國Sigma公司(批號：34075217)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)、處理和分組：采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)CF，培養(yǎng)條件為5% CO2和37℃。每2 d換一次培養(yǎng)液，當細胞融合度達80%～90%時，加0.25%胰蛋白酶消化傳代，收集第3～5代細胞進行實驗。取對數(shù)期CF接種于6孔板中(2×105個/孔)，將細胞分為3組進行實驗，即NC組、Hcy組、EX527+Hcy組。NC組為正常培養(yǎng)的CF；Hcy組的細胞長滿85%以上時，換含0.5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入10 μL濃度為0.5 mmol/L的Hcy刺激細胞，培養(yǎng)24 h后進行后續(xù)實驗；EX527+Hcy組細胞在給予10 μL濃度為0.5 mmol/L濃度的Hcy刺激后立即加入10 mL的SIRT1/p53通路抑制劑EX527(1 μmol/L)，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進行后續(xù)實驗。

1.2.2 CCK-8法檢測CF增殖能力：調(diào)整CF密度至4×105個細胞/mL，接種于96孔板(2×103個細胞/孔)，培養(yǎng)24 h后，向每個待測孔加入10 μL的CCK-8試劑，37℃孵育2 h，使用酶標儀(無錫集佳智能科技有限公司，型號：ZG-660)在490 nm波長下檢測細胞的光密度值(A)，計算細胞存活率，細胞存活率(%)=A實驗組/A對照組×100%。每組設(shè)置3個復孔，實驗重復3次。

1.2.3 流式細胞術(shù)檢測CF凋亡率：收集各組CF，重懸于500 μL 1×結(jié)合緩沖液中。按照凋亡檢測試劑盒依次加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，避光染色30 min。1 h內(nèi)上流式細胞儀(德國Partec公司，型號：CyFlow? Space)檢測細胞凋亡率。每組設(shè)置3個復孔，實驗重復3次。

1.2.4 實時熒光定量PCR檢測COL1A1、COL3A1、Acta2 mRNA相對表達水平：使用TRIzol試劑提取各組CF的總RNA，然后使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒生成cDNA，利用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ在熒光定量PCR儀(美國Agilenti公司，型號：Mx3005P)上進行反應。以cDNA為模板進行實時熒光定量PCR擴增。反應體系為10×PCR Buffer 2.5 μL，MgSO42.5 μL，dNTPs 2.5 μL，正反向引物各0.5 μL，cDNA 2 μL，RNase-Free ddH2O補足體系至25 μL。反應條件為95℃預變性60 s，95℃變性60 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40次循環(huán)。COL1A1正向引物5′-CTGGTCCTGTTGGAAGTCGT-3′，反向引物5′-CAGATGCACCTGTTTCTCCA-3′； COL3A1正向引物5′-CTGGCGGCTTTTCACCATAT-3′，反向引物5′-TCTCCGCTCTTGAGTTCAGG-3′；Acta2正向引物5′-CTGTGCTATGTCGCTCTGGA-3′，反向引物5′-ATAGGTGGTTTCGTGGATGC-3′；GAPDH正向物5′-CAAGAAGGTGGTGAAGCAGG-3′，反向引物5′-CCACCCTGTTGCTGTAGCC-3′。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算相對表達量，其中ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因，ΔΔCt=ΔCt實驗組-ΔCt對照組。每組設(shè)置3個復孔，實驗重復3次。

1.2.5 蛋白免疫印跡實驗檢測COL1A1、COL3A1、Acta2、SIRT1、Ac-p53蛋白相對表達水平：使用二喹啉甲酸蛋白提取試劑盒提取各組CF的總蛋白，檢測蛋白濃度后進行變性處理，取30 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE反應，轉(zhuǎn)到PVDF，封閉，分別加入一抗稀釋液(1 ∶1 000)，4 ℃孵育24 h，TBST洗滌，分別加入二抗稀釋液(1 ∶2 000)，室溫孵育1 h，暗室內(nèi)曝光顯影，應用Image J軟件分析各條帶灰度值。每組設(shè)置3個復孔，實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以(x±s)表示， 多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 3組CF存活率的比較 與NC組比較，Hcy組CF存活率升高(P<0.05)；與Hcy組比較，EX527+Hcy組細胞存活率降低(P<0.05)。見表1。

表1 3組CF存活率 的比較(x±s，%)

2.2 3組CF凋亡率的比較 與NC組比較，Hcy組CF凋亡率降低(P<0.05)；與Hcy組比較，EX527+Hcy組細胞增殖率升高(P<0.05)。見表2和圖1。

表2 3組CF凋亡率的比較(x±s，%)

圖1 各組細胞凋亡情況

2.3 3組CF中纖維化相關(guān)因子的mRNA和蛋白相對表達水平的比較 與NC組比較，Hcy組CF中COL1A1、COL3A1和Acta2 mRNA和蛋白相對表達水平均升高(均P<0.05)；與Hcy組比較，EX527+Hcy組CF中COL1A1、COL3A1和Acta2 mRNA和蛋白相對表達水平均降低(均P<0.05)。見表3和圖2。

表3 3組CF中纖維化相關(guān)因子mRNA和蛋白相對表達水平的比較(x±s)

圖2 3組CF中纖維化相關(guān)因子的蛋白表達情況

2.4 3組CF中SIRT1/p53通路相關(guān)蛋白相對表達水平的比較 與NC組比較，Hcy組CF細胞中SIRT1蛋白相對表達水平升高，而Ac-p53蛋白相對表達水平降低(均P<0.05)；與Hcy組比較，EX527+Hcy組細胞中SIRT1蛋白相對表達水平降低，而Ac-p53蛋白相對表達水平升高(均P<0.05)。見表4和圖3。

表4 3組CF中SIRT1/p53通路相關(guān)蛋白相對表達水平的比較(x±s)

圖3 3組CF中SIRT1/p53通路相關(guān)蛋白的表達情況

3 討 論

心肌纖維化是高血壓所致心肌重構(gòu)的重要病理特征，是發(fā)生心律失常的基礎(chǔ)，也是心力衰竭的潛在危險因素[8]。CF能夠合成應力纖維、纖維化相關(guān)基因子COL1A1、COL3A1和Acta2的基因和蛋白，心肌纖維化是CF形成并活化的過程[9-10]。Hcy是一種含硫氨基酸，Hcy升高是造成心肌纖維化的主要原因。動物實驗表明，Hcy可誘導大鼠心肌微血管內(nèi)皮細胞損傷[11]，而降低Hcy表達水平可以延緩酒精性心肌病大鼠的心肌纖維化[12]。王潔文[13]的研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性高血壓患者血漿Hcy水平與心肌纖維化關(guān)系密切。因此，本實驗使用Hcy誘導CF以模擬心肌纖維化，并以CF中纖維化相關(guān)因子COL1A1、COL3A1和Acta2等[14]作為觀察指標，結(jié)果顯示，經(jīng)Hcy誘導后CF的增殖率升高，而凋亡率降低，細胞中COL1A1、COL3A1和Acta2的 mRNA和蛋白相對表達水平均升高，提示成功建立心肌纖維化模型。

SIRT1與p53的相互作用可抑制細胞凋亡[7]，兩者對多種心血管病變均具有改善作用。龐明[15]的研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1對Hcy誘導的血管內(nèi)皮細胞衰老起到保護作用；鄔云斌等[16]研究表明，白藜蘆醇對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用與SIRT1/p53通路有關(guān)系。此外，抑制SIRT1表達水平對乳鼠CF的活性有明顯的抑制作用[17]。S-腺苷同型半胱氨酸可在S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(S-adenosine homocysteine hydrolase,SAHH)的作用下可分解為腺苷和Hcy。糖尿病心肌病的病因之一是由糖基化的膠原沉積所致心肌間質(zhì)纖維化，而SAHH和Hcy水平升高可能是大鼠早期糖尿病心肌病發(fā)生和發(fā)展的重要機制，而SIRT1水平升高可抑制SAHH水平從而緩解的糖尿病心肌病[18]。本實驗結(jié)果顯示，給予SIRT1/p53通路抑制劑EX527干預后，EX527+Hcy組SIRT1蛋白相對表達水平降低，Ac-p53蛋白相對表達水平升高，提示EX527成功抑制SIRT1/p53通路；EX527+Hcy組CF增殖率降低，細胞凋亡率升高，細胞中的COL1A1、COL3A1和Acta2 mRNA和蛋白相對表達水平均降低(均P<0.05)，這表明抑制SIRT1/p53通路可以減輕Hcy誘導的心肌纖維化程度。

綜上所述，Hcy可促進CF增殖而抑制其凋亡，從而誘導心肌纖維化的發(fā)生，而抑制SIRT1/p53信號通路可以減輕Hcy誘導的心肌纖維化。