陳亮 劉雪松 黃思琪 張蕾 馮萬(wàn)宇 李丹 蘭世捷 苗艷 沈思思 黃寶銀 史同瑞*

1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院 161005

2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 150030

大腸桿菌可以引起仔豬的腹瀉，根據(jù)豬的日齡以及和致病性大腸桿菌的血清型不同，可以將仔豬腹瀉疾病分為仔豬黃痢、仔豬白痢以及仔豬水腫病等。引起仔豬腹瀉大腸桿菌的致病因子較多，包括了黏附素和腸毒素等。在仔豬腹瀉大腸桿菌中常見(jiàn)的黏附素為K88、K99 以及987P 等。致病性大腸桿菌可以通過(guò)黏附素的黏附作用讓大腸桿菌定居在小腸上皮上，大量繁殖并分泌腸毒素，從而影響動(dòng)物機(jī)體的水分吸收排泄平衡，造成腹瀉。

2020 年10 月黑龍江齊齊哈爾市周邊某豬場(chǎng)發(fā)生仔豬腹瀉癥狀，對(duì)該豬場(chǎng)病死仔豬進(jìn)行剖檢，將無(wú)菌得到的病料進(jìn)行細(xì)菌的分離鑒定，測(cè)定其含有的毒力基因，并通過(guò)藥敏試驗(yàn)指導(dǎo)臨床用藥。

1 材料

1.1 病料無(wú)菌采集腹瀉仔豬病料，包括肝臟、脾臟以及小腸等。

1.2 試劑伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基，北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)。麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，山東拓普生物工程有限公司生產(chǎn)。MH 培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。50×TAE，北京拓奧達(dá)科技有限公司生產(chǎn)。革蘭氏染色液，常德比克曼生物科技有限公司生產(chǎn)。藥敏紙片，杭州濱和微生物試劑有限公司生產(chǎn)。Taq Master Mix，南京諾唯贊生物科技股份有限公司生產(chǎn)。DNA Marker，大連Takara 公司生產(chǎn)。

2 方法

2.1 病原菌分離培養(yǎng)將病料無(wú)菌接種到鑒別培養(yǎng)基中，觀察菌落形態(tài)，顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)。

2.2 黏附素毒力基因檢測(cè)根據(jù)相關(guān)參考文獻(xiàn)，合成相應(yīng)毒力基因，以細(xì)菌菌液為模板提取DNA 進(jìn)行擴(kuò)增。毒力基因引物序列如表1 所示。

表1 黏附素毒力基因引物序列

2.3 藥敏試驗(yàn)藥敏試驗(yàn)采用CLSI 指導(dǎo)進(jìn)行。將細(xì)菌培養(yǎng)到1.5×108CFU/mL，均勻涂抹于MH 瓊脂平板上，將藥敏紙片均勻安放在平板上，培養(yǎng)過(guò)夜后觀察結(jié)果。

3 結(jié)果與分析

3.1 腹瀉仔豬剖檢結(jié)果腹瀉仔豬剖檢結(jié)果如圖1 所示，可以看出腹瀉仔豬出現(xiàn)小腸積氣、腸出血以及卡他性腸炎癥狀。

圖1 腹瀉仔豬解剖圖

3.2 細(xì)菌分離鑒定及毒力基因檢測(cè)從病料中分離出來(lái)的細(xì)菌在伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上菌落呈現(xiàn)帶金屬光澤、邊緣整齊、光滑濕潤(rùn)的菌落。在麥康凱培養(yǎng)基上呈現(xiàn)粉紅色菌落。通過(guò)革蘭氏染色鏡檢后發(fā)現(xiàn)分離得到的細(xì)菌為革蘭氏陰性桿菌，多散在，兩端鈍圓?？梢源_定為分離的細(xì)菌為大腸桿菌。毒力基因檢測(cè)結(jié)果如圖2 所示。經(jīng)過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該株細(xì)菌攜帶K99 毒力基因，為產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌（ETEC）。

圖2 毒力基因檢測(cè)結(jié)果

3.3 藥敏試驗(yàn)結(jié)果通過(guò)藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該株細(xì)菌對(duì)左氧氟沙星、阿米卡星、頭孢曲松以及頭孢哌酮具有敏感性，對(duì)于四環(huán)素以及環(huán)丙沙星耐藥，對(duì)于慶大霉素處于中介狀態(tài)。

4 討論

引起仔豬腹瀉的多為產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌。其中豬源的產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌經(jīng)常攜帶的黏附素為K88、K99 以及987P 等。

豬大腸桿菌性腹瀉病的預(yù)防最主要的手段之一便是疫苗免疫。多種因素會(huì)影響最后仔豬獲得的免疫效果。卵黃抗體有著效價(jià)高、獲取量大以及性價(jià)比高的特點(diǎn)。最重要的是卵黃抗體粉可以直接作為飼料添加劑為仔豬提供主動(dòng)免疫力。路桂霞將K88、K99、987P 和F41 黏附素作為免疫抗原，制備出了抗仔豬大腸桿菌病卵黃抗體，并進(jìn)行了臨床試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該種特異性卵黃抗體對(duì)仔豬大腸桿菌病具有良好的防治效果。劉文鑫對(duì)大腸桿菌K88、K99 天然菌毛及表達(dá)蛋白卵黃抗體進(jìn)行了制備及初步應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)制備的卵黃抗體可與相應(yīng)的大腸桿菌發(fā)生特異性凝集，并對(duì)仔豬黃、白痢具有良好的防治作用。