馬文賢，黃瓊，董振耀

微小RNA（miRNA）為長度在19～23個核苷酸之間的短鏈非編碼微小RNA，其在多種疾病中均具有調(diào)控功能，其中包括牙周炎。微小RNA-218-5p（miR-218-5p）在牙周炎中的作用雖然已得到部分學(xué)者的肯定，但其調(diào)控機(jī)制與Notch 信號通路的關(guān)系尚未清楚。Notch 信號通路在維持細(xì)胞生長、分化方面具有關(guān)鍵作用，其在疾病的進(jìn)程中具有重要作用。Notch 信號通路通過Notch 蛋白與相鄰細(xì)胞上的配體Jagged 1（JAG1）蛋白結(jié)合而被激活，Notch蛋白的裂解在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生，導(dǎo)致Notch 細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域易位到細(xì)胞核中并進(jìn)一步調(diào)節(jié)Notch 靶基因表達(dá)。Notch 信號通路參與成骨分化過程和破骨細(xì)胞生成的誘導(dǎo)過程。但是miR-218-5p 與JAG1 在人牙周膜干細(xì)胞（hPDLSCs）中的作用關(guān)系尚不清楚。2018年12月至2019年9月，本研究擬以人牙周膜干細(xì)胞hPDLSCs 為研究對象，觀察抑制miR-218-5p、過表達(dá)JAG1 對hPDLSCs 細(xì)胞活性、分化的影響，揭示其機(jī)制，為牙周膜干細(xì)胞治療牙周炎，促進(jìn)牙周骨組織再生提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

hPDLSCs 購自ATCC；兔抗人JAG1、Ⅰ型膠原蛋白（Col-1）、骨鈣素、Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runx2）多克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）抗體均購自Santa Cruz；pcDNA 3.1 載體購自康為世紀(jì)；α-MEM 培養(yǎng)基購自Hyclone 公司；胎牛血清均購自Gibco 公司；噻唑藍(lán)（MTT）試劑盒購自美國GIBCO 公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000 購自北京索萊寶科技有限公司；BCA 蛋白定量試劑盒購自上海源葉生物公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連Takara 公司；聚偏二氟乙烯（PVDF）膜購自德國羅氏診斷有限公司；ECL發(fā)光液購自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；RIPA裂解液購自碧云天生物技術(shù)公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega 公司。實驗中所有引物的合成及序列均由上海吉瑪公司合成。

1.2 方法

1.2.1

細(xì)胞培養(yǎng) 用含10 %胎牛血清的α-MEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)人牙周膜干細(xì)胞hPDLSCs，置于37 ℃，5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2

細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將未做任何處理的hPDLSCs 細(xì)胞標(biāo)記為對照組；anti-miR-218-5p、anti-miR-NC、pcDNA、pcDNA-JAG1、anti-miR-218-5p+si-NC、antimiR-218-5p+si-JAG1 按照脂質(zhì)體Lipofectamine2000 說明書操作步驟要求轉(zhuǎn)染至正常培養(yǎng)的hPDLSCs 細(xì)胞，分別標(biāo)記為anti-miR-218-5p 組、antimiR-NC 組、pcDNA 組、pcDNA-JAG1 組、anti-miR-218-5p+si-NC 組、anti-miR-218-5p+si-JAG1 組，轉(zhuǎn)染48 h后，用實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRTPCR）檢測轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染成功后，用于后續(xù)試驗。

1.2.3

qRT-PCR 檢測細(xì)胞中miR-218-5p、Col-1、骨鈣素、Runx-2 的表達(dá) 為了觀察miR-218-5p、JAG1 對hPDLSCs 細(xì)胞中Col-1、骨鈣素、Runx-2 的mRNA 表達(dá)的調(diào)控，本探究通過抑制miR-218-5p、過表達(dá)JAG1、敲減JAG1 檢測其中Col-1、骨鈣素、Runx-2 的mRNA 表達(dá)情況。將對照組、anti-miR-218-5p 組、anti-miR-NC 組、pcDNA 組、pcDNA-JAG1組、anti-miR-218-5p+si-NC 組、anti-miR-218-5p+si-JAG1 組細(xì)胞，遵照RNA 抽提試劑盒說明書要求操作提取RNA，進(jìn)行定量，然后按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒按照說明書操作合成互補(bǔ)DNA（cDNA），相關(guān)序列信息見表1。最后按qRT-PCR 試劑盒說明書操作進(jìn)行miR-218-5p、Col-1、骨鈣素、Runx-2 檢測。用2計算miR-218-5p、Col-1、骨鈣素、Runx-2的表達(dá)。

表1 相關(guān)序列信息

1.2.4

MTT 法檢測細(xì)胞活性 調(diào)整對照組、antimiR-218-5p 組、anti-miR-NC 組、pcDNA 組、pcDNAJAG1 組、anti-miR-218-5p+si-NC 組、anti-miR-218-5p+si-JAG1 組細(xì)胞密度至10/mL，取200 μL，加入20 μL 5 g/L的MTT溶液，培養(yǎng)4 h，然后棄去上清，每孔加入150 μL二甲基亞砜（DMSO），震蕩，使結(jié)晶溶解，在490 nm波長下檢測細(xì)胞吸光度。

1.2.5

茜素紅染色實驗 將對照組、anti-miR-218-5p 組、anti-miR-NC 組hPDLSCs 細(xì)胞調(diào)整至10/mL，然后接種在6 孔板中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，棄去未貼壁的細(xì)胞和培養(yǎng)液，用10 nmol/L 地塞米松、10 mmol/L β甘油酸鈉及50 mg/L 維生素C 的α-MEM 成骨誘導(dǎo)液或者10 μg/L轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）的α-MEM成骨誘導(dǎo)液處理hPDLSCs。每2～3天換液，分別培養(yǎng)14 d、21 d、28 d，在倒置顯微鏡下觀察礦化結(jié)節(jié)的形成。

1.2.6

蛋白質(zhì)印跡法（Westrn blotting）實驗檢測細(xì)胞中JAG1、Col-1、骨鈣素、Runx-2 的蛋白表達(dá) 收集對照組、anti-miR-218-5p 組、anti-miR-NC 組、pcDNA 組、pcDNA-JAG1 組、anti-miR-218-5p+si-NC 組、anti-miR-218-5p+si-JAG1 組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至10/mL，加入裂解液，冰上裂解30 min。12000 r/min離心10 min。取上清置于離心管，加入5×SDS 上樣緩沖液，沸水煮沸10 min。電泳后用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜；5 %脫脂奶粉將膜封閉2 h，洗膜，加入Ⅰ抗（1∶500 倍稀釋的兔抗人JAG1、Col-1、骨鈣素、Runx-2 多克隆抗體），4 ℃過夜孵育，洗膜，加Ⅱ抗（1∶1000倍稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG），4 ℃，2 h。加發(fā)光液，曝光。

1.2.7

雙熒光素酶報告基因檢測實驗 將目的基因JAG1-WT 和JAG1-MUT 進(jìn)行XhoⅠ和NotⅠ酶切，并回收目的片段，克隆至PUC-T 載體。再將目的序列與psiCHECK-2 載體鏈接，點擊法插入DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，再用500 μL LB 液體培養(yǎng)基進(jìn)行搖菌和優(yōu)勢菌落挑選，擴(kuò)大優(yōu)勢菌落培養(yǎng)，最后提取質(zhì)粒DNA。用脂質(zhì)體法將psiCHECK2-JAG1-3′非翻譯區(qū)（UTR）WT、psiCHECK2-JAG1-3′UTR MUT 轉(zhuǎn)染至對照組、miR-218-5p 組、miR-NC 組細(xì)胞。最后按雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒技術(shù)手冊要求操作。psiCHECK2 載體以螢火蟲熒光素酶活性為內(nèi)參，psiCHECK2-JAG1-3′UTR WT 和psiCHECK2-JAG1-3′UTR MUT 的表達(dá)為對照，檢測熒光強(qiáng)度。海腎熒光素酶的發(fā)光強(qiáng)度與螢火蟲熒光素酶發(fā)光強(qiáng)度的比值反映miR-218-5p與JAG1的結(jié)合力。

2 結(jié)果

2.1 抑制miR-218-5p 表達(dá)對hPDLSCs 活性的影響

與anti-miR-NC 組相比，anti-miR-218-5p 組hPDLSCs 細(xì)胞中miR-218-5p 表達(dá)顯著降低（

P

＜0.001），48、72 h時，細(xì)胞活性顯著升高（均

P

＜0.001）。見表2。

表2 抑制miR-218-5p表達(dá)對人牙周膜干細(xì)胞（hPDLSCs）活細(xì)胞數(shù)的影響/±s

2.2 抑制miR-218-5p 表達(dá)對hPDLSCs 骨向分化的影響

與anti-miR-NC 組相比，anti-miR-218-5p 組hPDLSCs 細(xì)胞的礦化結(jié)節(jié)明顯升高，Col-1、骨鈣素、Runx-2 的mRNA 和蛋白的相對表達(dá)量均顯著升高（均

P

＜0.001）。見圖1、圖2、表3。

圖1 抑制miR-218-5p表達(dá)觀察人牙周膜干細(xì)胞（hPDLSCs）骨向分化時礦化結(jié)節(jié)的形成（茜素紅染色×100）

圖2 蛋白質(zhì)印跡法檢測抑制miR-218-5p表達(dá)后人牙周膜干細(xì)胞（hPDLSCs）骨向分化時Col-1、骨鈣素、Runx-2蛋白電泳圖

表3 抑制miR-218-5p表達(dá)對人牙周膜干細(xì)胞（hPDLSCs）骨向分化的影響/±s

2.3 JAG1 過表達(dá)對hPDLSCs 活性和骨向分化的影響

與pcDNA 組相比，pcDNA-JAG1 組hPDLSCs細(xì)胞中JAG1 蛋白表達(dá)顯著升高（

P

＜0.001），48、72 h時，細(xì)胞活性顯著升高（均

P

＜0.001），Col-1、骨鈣素、Runx-2 的mRNA 的相對表達(dá)量和蛋白表達(dá)量均顯著升高（均

P

＜0.001）。見表4。

表4 JAG1過表達(dá)對人牙周膜干細(xì)胞（hPDLSCs）活性和骨向分化的影響/±s

2.4 miR-218-5p 靶向調(diào)控JAG1 的表達(dá)

運用miRcode 數(shù)據(jù)庫預(yù)測到miR-218-5p 與JAG13′UTR存在結(jié)合位點（圖3）；雙熒光素酶活性檢測結(jié)果顯示，與miR-NC 組相比，miR-218-5p 組WT-JAG1 細(xì)胞中熒光活性顯著降低（

P

＜0.001），MUT-JAG1 細(xì)胞中熒光活性不受影響（

P

=0.308），見表5。對照組、miR-NC 組、miR-218-5p 組、anti-miR-NC 組及antimiR-218-5p 組細(xì)胞中JAG1 蛋白相對表達(dá)量分別為（0.45±0.04）、（0.52±0.05）、（0.21±0.03）、（0.49±0.04）及（0.84±0.08）（

F

=175.396，

P

＜0.001）；與miR-NC 組相比，miR-218-5p 組JAG1 蛋白相對表達(dá)顯著降低（

P

＜0.001），與anti-miR-NC 組相比，anti-miR-218-5p組JAG1蛋白相對表達(dá)顯著升高（

P

＜0.001）。

圖3 Jagged-1（JAG1）的3’非翻譯區(qū)（UTR）中含有與miR-218-5p互補(bǔ)的核苷酸序列

表5 雙熒光素酶報告實驗/±s

2.5 抑制JAG1 表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制miR-218-5p 表達(dá)對hPDLSCs 活性骨向分化的作用

結(jié)果如圖4 和表6所示，與anti-miR-NC組相比，anti-miR-218-5p組hPDLSCs 細(xì)胞中JAG1 蛋白表達(dá)顯著升高（

P

＜0.001），48、72 h 時，活細(xì)胞數(shù)顯著升高（均

P

＜0.001），Col-1、骨鈣素、Runx-2 的mRNA 和蛋白的相對表達(dá)量均顯著升高（均

P

＜0.001）；與anti-miR-218-5p +si-NC 組 相比，anti-miR-218-5p +si-JAG1 組hPDLSCs 細(xì)胞中JAG1 蛋白表達(dá)顯著降低（

P

＜0.001），48、72 h 時，細(xì)胞增殖顯著降低（均

P

＜0.001），Col-1、骨鈣素、Runx-2 的mRNA 和蛋白的相對表達(dá)量均顯著降低（均

P

＜0.001）。

表6 抑制JAG1表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制miR-218-5p表達(dá)對人牙周膜干細(xì)胞（hPDLSCs）增殖骨向分化的作用/±s

圖4 蛋白質(zhì)印跡法檢測人牙周膜干細(xì)胞（hPDLSCs）JAG1、Col-1、OCN、Runx-2蛋白電泳圖

3 討論

miRNA 在人類各種疾病的發(fā)生發(fā)展中均具有調(diào)節(jié)作用，其中包括牙周組織流失。Hao 等使用微陣列分析成骨分化期間的miRNA 表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)，miR-218-5p 是其中差異表達(dá)的miRNA 之一。李建嘉等通過誘導(dǎo)hPDLSCs 發(fā)生成骨分化，檢測其中miR-218-5p 及成骨相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)分化后miR-218-5p 表達(dá)下調(diào)，miR-218-5p 在hPDLSCs 成骨分化過程中可能起負(fù)調(diào)控作用。最近Guo等在研究中發(fā)現(xiàn)，miR-218 的過度表達(dá)可以抑制Ⅰ型和Ⅳ型膠原蛋白和牙本質(zhì)唾液蛋白（DSP）的降解，抑制破骨細(xì)胞的形成，并抑制促炎細(xì)胞因子的分泌，其機(jī)制與靶向基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）相關(guān)。Zhong 等研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA CCAT1 通過負(fù)調(diào)控miR-218 促進(jìn)牙周膜細(xì)胞細(xì)胞增殖和分化。本研究運用MTT、qRT-PCR 法檢測了抑制miR-218-5p 的hPDLSCs 細(xì)胞的活性和成骨相關(guān)基因Col-1、骨鈣素、Runx-2 的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞活性顯著增強(qiáng)，成骨相關(guān)基因Col-1、骨鈣素、Runx-2的表達(dá)水平明顯上調(diào)，說明抑制miR-218-5p 具有促進(jìn)hPDLSCs 細(xì)胞成骨分化的功能，提示miR-218-5p 具有促進(jìn)人牙周膜干細(xì)胞分化的潛力。而Guo等在牙周炎的研究中支持過表達(dá)miR-218能夠通過減輕牙周炎病人的骨吸收和炎癥達(dá)到保護(hù)作用，這說明miR-218-5p 在牙周膜干細(xì)胞中的功能與在牙周炎病人中的功能存在差異，但本課題組并沒有在實驗動物體內(nèi)進(jìn)行驗證，這也為臨床試驗提供參考。深入研究，通過生物信息學(xué)、雙熒光素酶報告基因檢測實驗驗證miR-218-5p 與JAG1 存在靶向負(fù)調(diào)控的關(guān)系，這為miR-218-5p在成骨分化中的作用機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

JAG1 和Notch1 是Notch 信號通路的關(guān)鍵基因，該通路是細(xì)胞間發(fā)生作用的重要機(jī)制，近幾年其在成骨分化中的功能成為研究的熱點。袁萍等報道，在牙周炎病人牙周膜干細(xì)胞中Notch 信號通路受到抑制，而在輕微牙周炎癥病人中，激活Notch信號通路有助于病人缺損牙槽骨的成骨分化。張文等研究發(fā)現(xiàn)，在hPDLSCs 細(xì)胞不發(fā)生增殖的情況下，成骨相關(guān)基因及Notch 信號通路的配體表達(dá)發(fā)生上調(diào)。最近，馬玉等研究顯示，在PDLSCs 發(fā)生增殖時，成骨標(biāo)志基因的表達(dá)量發(fā)生下調(diào)，Notch信號通路相關(guān)分子JAG1 發(fā)生下調(diào)，提示Notch 信號通路可調(diào)控PDLSCs 的骨向分化能力。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)JAG1 可增強(qiáng)細(xì)胞的活性，促進(jìn)成骨相關(guān)基因Col-1、骨鈣素、Runx-2 的表達(dá)，可見，過表達(dá)JAG1具有促進(jìn)hPDLSCs細(xì)胞發(fā)生骨向分化的功能，這與前人的激活Notch 信號通路可治療牙周炎牙槽缺損的實驗結(jié)果相一致，這是首次在體外驗證Notch 信號通路關(guān)鍵基因JAG1 具有促進(jìn)hPDLSCs細(xì)胞骨向分化的功能。深入研究發(fā)現(xiàn)，抑制JAG1表達(dá)可逆轉(zhuǎn)抑制miR-218-5p 對hPDLSCs 的活性和骨向分化作用。

綜上所述，抑制miR-218-5p 可促進(jìn)人牙周膜干細(xì)胞發(fā)生成骨分化，其作用機(jī)制與靶向JAG1 相關(guān)，為牙周膜干細(xì)胞用于治療人牙周疾病奠定理論基礎(chǔ)。

（本文圖1見插圖12-3）