易禮俊，徐其銀，黃君

甲狀腺癌已成為我國發(fā)病率上升最快的惡性腫瘤之一，屬于常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病。依據(jù)甲狀腺癌的病理組織特征可分為濾泡狀甲狀腺癌、乳頭狀甲狀腺癌、甲狀腺未分化癌、甲狀腺髓樣癌。乳頭狀甲狀腺癌占所有甲狀腺癌病理類型的90% 左右，且具有較高的復(fù)發(fā)率，造成不良預(yù)后。隨著中醫(yī)藥的不斷發(fā)展，以多種形式出現(xiàn)的中醫(yī)藥為甲狀腺癌的臨床診療提供了新的策略和方法，具有良好的應(yīng)用前景。

吳茱萸堿（Evodiamine），分子式為CHNO，是從蕓香科植物吳茱萸中提取出的一種吲哚喹唑啉生物堿，呈白色或淡黃色粉末。最近研究結(jié)果表明：吳茱萸堿具有抗腫瘤活性，對(duì)人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、卵巢癌細(xì)胞系A(chǔ)2780、結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT-116、人胃癌細(xì)胞系SGC-7901、人胰腺癌細(xì)胞系SW1990、人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251等多種腫瘤細(xì)胞系都具有抑制作用。吳茱萸堿對(duì)人甲狀腺癌是否也具有抑制作用，還值得進(jìn)一步探究。本研究于2019年5—8月探討吳茱萸堿對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞TPC-1 增殖和凋亡的影響，以期為臨床治療甲狀腺癌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1

細(xì)胞與試劑 人甲狀腺癌TPC-1 細(xì)胞系，購自南京科佰生物科技有限公司；吳茱萸堿購自南京道斯夫生物科技有限公司；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶購自美國Gibco 公司；GoTaq? qPCR Master Mix購自美國Promega公司；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）凋亡檢測(cè)試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司；RNAisoplus、PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser 均購自寶生物工程（大連）有限公司；噻唑藍(lán)（MTT）細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒、存活蛋白兔單克隆抗體、胱天蛋白酶-3（caspase-3）兔單克隆抗體、叉頭框蛋白3（Foxp3）兔單克隆抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）兔單克隆抗體均購自abcam 公司；其他的常規(guī)化學(xué)試劑均購自上海生工生物公司。

1.1.2

儀器 MCO-5AC 型二氧化碳培養(yǎng)箱購自日本三洋；DFM-60 倒置熒光顯微鏡購自上海光學(xué)儀器廠；SJ-CJ-1FD 超凈工作臺(tái)購自蘇潔醫(yī)療器械（蘇州）有限公司；CytoFLEX 流式細(xì)胞儀購自美國貝克曼庫爾特公司；ABI 7500 型定量PCR 儀購自美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

1.2 方法

1.2.1

細(xì)胞株及培養(yǎng) 將甲狀腺癌TPC-1 細(xì)胞系，接種于含10% 胎牛血清、鏈霉素（0.1 g/L）和青霉素（100 U/mL）的DMEM 培養(yǎng)液中，放置37 ℃、5% 二氧化碳的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2

MTT 法檢測(cè)甲狀腺癌TPC-1 細(xì)胞的增殖取適宜細(xì)胞接種96孔板，繼續(xù)培養(yǎng)，分組處理（實(shí)驗(yàn)組分別加入終濃度為1、3、6、8 μmol/L 的吳茱萸堿；對(duì)照組：不加任何藥物），每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，分別作用24、48、72 h，每孔加入MTT 溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，加二甲基亞砜（DMSO），使結(jié)晶物充分溶解，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于波長(zhǎng)為490 nm 處檢測(cè)各孔吸光度，根據(jù)結(jié)果計(jì)算各組細(xì)胞存活率。存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組吸光度－本底組吸光度）/（對(duì)照組吸光度－本底組吸光度）×100%

1.2.3

Annexin V-FITC/PI 雙染法檢測(cè)凋亡率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的TPC-1 細(xì)胞接種于6 孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)12 h 后，分別加入0、1、3、6、8 μmol/L 的吳茱萸堿。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，制成單細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)。取10萬重懸的細(xì)胞，離心棄上清，加入195 μL Annexin VFITC 結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，再加入5 μL Annexin V-FITC，輕輕混勻，室溫下避光孵育10 min。之后，1000 r/min 離心5 min，棄上清，加入190 μL Annexin V-FITC 結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞，再加入10 μL PI 染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，AnnexinV-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。

1.2.4

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)檢測(cè)存活蛋白、caspase-3 和Foxp3 的mRNA 表達(dá) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的TPC-1 細(xì)胞按5×10個(gè)/孔的密度均勻鋪在6 孔板中，加入不同濃度（0、3、8 μmol/L）吳茱萸堿細(xì)胞培養(yǎng)液作用48 h 后，用RNAisoplus 提取總RNA，再參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptRT reagent Kit with gDNA Eraser 將提取的總RNA 逆轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)DNA（cDNA），采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)存活蛋白、caspase-3 和Foxp3 的表達(dá)情況，以GAPDH 和人內(nèi)源性微球蛋白（B2M）作為內(nèi)參。用Beacon Designer 8軟件設(shè)計(jì)特異性的熒光引物（見表1）。設(shè)置反應(yīng)體系，10 μL GoTaq? qPCR Master Mix、0.5 μmol/L 正向或反向引物、0.5 μL cDNA、用雙蒸水補(bǔ)足20 μL。設(shè)置反應(yīng)程序，95 ℃預(yù)變性5 min，1個(gè)循環(huán)，95 ℃變性10 s，59 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，45個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品進(jìn)行3 次重復(fù)，用無轉(zhuǎn)錄反應(yīng)模板和無模板作陰性對(duì)照。2的方法進(jìn)行相對(duì)定量分析。

表1 用于RT-qPCR的引物

1.2.5

蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)存活蛋白、caspase-3 和Foxp3 的蛋白表達(dá) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的TPC-1 細(xì)胞按5×10個(gè)/孔的密度均勻鋪在6孔板中，加入不同濃度（0、3、8 μmol/L）吳茱萸堿細(xì)胞培養(yǎng)液作用48 h 后，以RIPA 裂解液在冰上裂解細(xì)胞10 min，12000 r/min 離心15 min（4 ℃），收集上清液，BCA 試劑盒測(cè)定樣品總蛋白含量。取30～40 μg樣品，進(jìn)行10% 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），麗春紅染色（檢測(cè)電泳結(jié)果），轉(zhuǎn)膜，5% 脫脂奶粉封閉，一抗4 ℃過夜，二抗恒溫?fù)u床1 h，采用ECL 曝光成像，凝膠成像系統(tǒng)分析。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)TPC-1 細(xì)胞增殖的抑制作用

MTT 檢測(cè)結(jié)果表明，吳茱萸堿對(duì)TPC-1 細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯抑制作用，且隨藥物濃度和作用時(shí)間的增加而增強(qiáng)。見表2。

表2 不同濃度吳茱萸堿處理甲狀腺癌TPC-1細(xì)胞不同時(shí)間的細(xì)胞存活率比較/（%，±s）

2.2 Annexin V-FITC/PI 雙染法檢測(cè)凋亡率

經(jīng)過流式細(xì)胞儀的檢測(cè)，0（對(duì)照組）、1、3、6、8 μmol/L吳茱萸堿組細(xì)胞凋亡率分別為（5.61±0.83）%、（7.93±1.02）% 、（12.34±2.52）% 、（18.92±3.14）% 、（23.12±4.25）%。由此可知，與對(duì)照組相比，細(xì)胞凋亡率隨著吳茱萸堿濃度的升高而增加（

F

=22.564，

P

＜0.001；1、3、6、8 μmol/L 吳茱萸堿組分別與對(duì)照組相比，

t=

1.058、3.073、6.075、7.994，

P

=0.315、0.012、0.000、0.000）。

2.3 對(duì)TPC-1細(xì)胞存活蛋白、caspase-3和Foxp3的mRNA 表達(dá)的影響

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，吳茱萸堿作用TPC-1 細(xì)胞48 h 后，與對(duì)照組（1.00±0.05）相比，3 μmol/L 組（0.63±0.04）、8 μmol/L組（0.20±0.05）存活蛋白mRNA 的表達(dá)降低，吳茱萸堿可明顯下調(diào)TPC-1 細(xì)胞中存活蛋白的表達(dá)（

F

=232.005，

P

＜0.001）。與對(duì)照組（1.00±0.06）相比，3 μmol/L 組（1.68±0.06）、8 μmol/L 組（2.32±0.06）caspase-3 mRNA 的表達(dá)升高，吳茱萸堿可明顯上調(diào)TPC-1 細(xì)胞中caspase-3 的表達(dá)（

F

=376.945，

P

＜0.001）。 與對(duì)照組（1.00±0.03）相比，3 μmol/L 組（0.56±0.06）、8 μmol/L 組（0.12±0.03）Foxp3 mRNA的表達(dá)降低，吳茱萸堿可明顯下調(diào)TPC-1 細(xì)胞中Foxp3 的表達(dá)（

F

=384.445，

P

＜0.001）。因此，吳茱萸堿可明顯下調(diào)TPC-1細(xì)胞中MMP-2、Foxp3 mRNA表達(dá)，上調(diào)TPC-1細(xì)胞中caspase-3 mRNA表達(dá)。

2.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果

吳茱萸堿作用TPC-1細(xì)胞48 h 后，與對(duì)照組比較，吳茱萸堿組可明顯下調(diào)TPC-1 細(xì)胞中存活蛋白和Foxp3 蛋白表達(dá)，上調(diào)caspase-3蛋白表達(dá)，見圖1，表3。

圖1 各組甲狀腺癌TPC-1細(xì)胞的存活蛋白、caspase-3和Foxp3的蛋白表達(dá)

表3 不同濃度吳茱萸堿對(duì)甲狀腺癌TPC-1細(xì)胞存活蛋白、caspase-3和Foxp3蛋白表達(dá)的影響/±s

3 討論

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，吳茱萸堿對(duì)眾多腫瘤細(xì)胞有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，其機(jī)制涉及抑制腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移、阻滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、促進(jìn)自噬等。但其抗甲狀腺癌的活性及機(jī)制闡述還缺乏進(jìn)一步的研究。

蘇文洲等研究表明吳茱萸堿可降低人骨肉瘤HOS 細(xì)胞的細(xì)胞活性，抑制其體外增殖并誘導(dǎo)其凋亡，其機(jī)制可能與其上調(diào)caspase-3 蛋白的表達(dá)、下調(diào)B細(xì)胞淋巴瘤-2（Bcl-2）蛋白的表達(dá)有關(guān)。本研究中筆者采用MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活性，發(fā)現(xiàn)吳茱萸堿能顯著抑制甲狀腺癌的增殖能力，且增殖抑制能力呈濃度和時(shí)間依賴性，8 μmol/L 吳茱萸堿作用72 h后，其抑制率可達(dá)98.15%，這與其它文獻(xiàn)報(bào)道的其作用于其他腫瘤的報(bào)道相一致。利用Annexin VFITC/PI雙染法檢測(cè)凋亡率，發(fā)現(xiàn)凋亡率隨著吳茱萸堿濃度的增加而逐漸增多。吳茱萸堿對(duì)甲狀腺癌細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用也與先前其作用與其他腫瘤的報(bào)道相一致。

存活蛋白是凋亡抑制蛋白家族的新成員，通過抑制caspase-3和胱天蛋白酶-7（caspase-7）阻斷細(xì)胞凋亡，參與促進(jìn)細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞有絲分裂和血管生成等。caspase-3 是多種凋亡途徑最主要的下游效應(yīng)因子之一，是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵酶，在各種因素啟動(dòng)的凋亡程序中起最后樞紐作用，直接參與細(xì)胞凋亡的發(fā)生。當(dāng)?shù)蛲龃碳r(shí)，胞質(zhì)中的線粒體存活蛋白能迅速釋放，從而阻止caspases 活化，抑制細(xì)胞凋亡。有研究發(fā)現(xiàn)，存活蛋白表達(dá)與caspase-3蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。Shin 等認(rèn)為，存活蛋白不是通過抑制起始caspase-8，而是通過結(jié)合并抑制caspase-3 和caspase-7 的活性來阻止細(xì)胞凋亡。呂琳娜等研究表明姜黃揮發(fā)油通過顯著上調(diào)caspase-3 的表達(dá)，下調(diào)存活蛋白的表達(dá)促進(jìn)人皮膚鱗癌SCL-1細(xì)胞的體外凋亡。本研究結(jié)果表明吳茱萸堿通過下調(diào)存活蛋白和上調(diào)caspase-3 促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞凋亡，與上述結(jié)論一致。

另外，本研究也發(fā)現(xiàn)Foxp3 的表達(dá)水平下調(diào)。Foxp3 是叉頭/翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子家族中的一個(gè)成員，在人體免疫系統(tǒng)發(fā)展和行使功能過程中發(fā)揮重要作用的。Foxp3 不但在Tregs 細(xì)胞表達(dá)，而且與Tregs 細(xì)胞的數(shù)量呈正相關(guān)。推測(cè)下調(diào)Foxp3 表達(dá)水平的可能是為了降低腫瘤微環(huán)境中Tregs 細(xì)胞數(shù)量，解除機(jī)體免疫抑制，增強(qiáng)抗腫瘤免疫功能。上述推測(cè)已在陸恬等的研究中得到證實(shí)。另外，也有研究表明FOXP3 是一種癌因子，在甲狀腺癌組織中的表達(dá)也明顯高于健康對(duì)照組，高Foxp3 表達(dá)組多表現(xiàn)為腫瘤直徑較大且多出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，復(fù)發(fā)率較低Foxp3 表達(dá)組高，沉默F(xiàn)OXP3 表達(dá)除了會(huì)抑制的腫瘤發(fā)生和發(fā)展，也會(huì)增加腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。本研究的結(jié)果與其一致。

綜上所述，吳茱萸堿能夠抑制甲狀腺癌癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，其機(jī)制可能與其抑制存活蛋白、Foxp3，上調(diào)caspase-3的表達(dá)有關(guān)。