曾興穎 吳華平 曾 苗 虞雄鷹 劉志強(qiáng)

進(jìn)行性肌營養(yǎng)不良(PMD)是一組原發(fā)性肌肉疾病，臨床主要表現(xiàn)為進(jìn)行性肌力減退和肌肉萎縮，常見于男性，主要包括Duchenne型肌營養(yǎng)不良(DMD)和Becker型肌營養(yǎng)不良(BMD)。DMD和BMD均由編碼抗肌萎縮蛋白(dystrophin)的DMD基因突變引起。DMD基因突變，若不改變開放閱讀框，則能形成縮短的dystrophin蛋白，臨床表現(xiàn)為較溫和的表型(BMD)；若改變了轉(zhuǎn)錄本的翻譯閱讀框或產(chǎn)生終止密碼子，則不能形成功能性dystrophin蛋白，臨床出現(xiàn)嚴(yán)重的表型(DMD)[1,2,3]。DMD發(fā)病率為1/5 000，約是BMD的3倍，屬于最常見的兒童神經(jīng)肌肉性疾病[1]，目前缺乏有效的治愈方法。既往臨床上常根據(jù)患兒喪失行走能力的時(shí)間是否早于16歲區(qū)分DMD和BMD[1]，兩者在臨床表現(xiàn)、壽命、長程管理和激素的治療劑量方面均有所不同，早期識(shí)別和區(qū)分DMD和BMD具有重要的臨床價(jià)值。本文對江西省兒童醫(yī)院(我院)收治的嬰幼兒PMD病例進(jìn)行回顧性分析，總結(jié)PMD患兒癥狀前期的特點(diǎn)，旨在早期識(shí)別DMD和BMD，以提供更好的疾病管理措施。

1 方法

1.1 倫理和知情同意 本研究獲得我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理審批號(hào)：JXSETYY-YXKY-20190035)和患兒監(jiān)護(hù)人的書面知情同意。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道和多個(gè)在線網(wǎng)站對DMD基因突變的描述[1，4]，結(jié)合生化評(píng)估[5]，本文采用以下嬰幼兒PMD診斷標(biāo)準(zhǔn)：①血清CK在病程早期甚至生后即增高，達(dá)正常值的10～50倍；②肌電圖提示肌源性損害；①和②為臨床診斷；③DMD基因變異位點(diǎn)經(jīng)ACMG評(píng)分評(píng)為致病性變異為確診指標(biāo)。

1.3 研究對象的納入標(biāo)準(zhǔn) ①2016年1月至2020年7月在我院神經(jīng)內(nèi)科住院或門診就診、符合PMD診斷的連續(xù)患兒；②年齡>28 d且≤3歲；③完善DMD基因檢測。

1.4 基因檢測

1.4.1 DMD基因檢測方法 經(jīng)監(jiān)護(hù)人知情同意后抽取患兒外周靜脈血2～3 mL，采用多重連接探針擴(kuò)增(MLPA)技術(shù)篩查DMD基因 79個(gè)外顯子缺失和(或)重復(fù)突變。如果樣本未檢測到外顯子缺失和(或)重復(fù)突變，通過二代測序法對DMD基因啟動(dòng)子區(qū)、5’非編碼區(qū)(5’UTR)、編碼區(qū)、轉(zhuǎn)錄終止區(qū)、內(nèi)含子剪切點(diǎn)附近10 bp以及有文獻(xiàn)報(bào)道或數(shù)據(jù)庫記錄的已知突變序列進(jìn)行測序。

1.4.2 基因診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]根據(jù)閱讀框規(guī)則，框移突變導(dǎo)致DMD，而框內(nèi)突變導(dǎo)致BMD，參考網(wǎng)址http://edystrophin.genouest.org/對突變位點(diǎn)進(jìn)行文獻(xiàn)檢索結(jié)合Dystrophin蛋白的功能預(yù)測進(jìn)行最終診斷。

1.5 分組 根據(jù)診斷年齡分為嬰兒組(>28 d且≤1歲)和幼兒組(～3歲)。根據(jù)基因檢測結(jié)果，分為DMD組(DMD基因移碼突變、無義突變、經(jīng)典剪切位點(diǎn)突變)和BMD組(DMD基因整碼突變、錯(cuò)義突變)，若有文獻(xiàn)或網(wǎng)站預(yù)測的特殊情況，則另行記錄。

1.6 臨床資料提取 設(shè)計(jì)統(tǒng)一的臨床資料收集表，查閱我院電子病歷系統(tǒng)，采集：①患兒的年齡、發(fā)育情況、四肢肌力、Gower征、家族史、入院主訴、診療經(jīng)過；②基因檢測結(jié)果；③血清酶水平：CK-MB、CK、LDH、ALT和AST；④肌電圖。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料以xˉ±S表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)(P25，P75)表示，組間比較采用Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法。以基因診斷結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，血清酶為待檢測標(biāo)準(zhǔn)，繪制ROC曲線獲取血清酶的界值，繪制四格表計(jì)算血清酶診斷DMD的診斷參數(shù)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 24例PMD患兒納入分析，均為男孩，2月齡至2歲11月。嬰兒組11例，平均年齡(0.6±0.3)歲；幼兒組13例，平均年齡(2.1±0.6)歲。

2.2 基因檢測結(jié)果 24例患兒及其父母均留取血液樣本，并對其父母行DMD基因突變點(diǎn)的驗(yàn)證，母親是該基因突變攜帶者19例(79.2%)，其中DMD組14例，BMD組5例；新發(fā)突變5例(20.8%)；兩組變異來源差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.63)。高通量檢測DMD基因變異結(jié)果顯示，大片段缺失15例(62.5%)，經(jīng)典剪切位點(diǎn)變異4例(16.7%)，點(diǎn)突變3例(12.5%)，大片段重復(fù)2例(8.3%)。24例中發(fā)生變異的外顯子有2個(gè)高頻突變區(qū)域，即位于中央?yún)^(qū)的第45～55號(hào)外顯子(17例，70.8%)和5’端第5～18號(hào)外顯子(4例，16.7%)，變異類型包括缺失、重復(fù)、剪切位點(diǎn)突變，而所有點(diǎn)突變均在此區(qū)域外。DMD組和BMD組突變涉及的外顯子分布大致相同(圖1)。DMD組18例，平均年齡(1.3±0.9)歲；BMD組6例，平均年齡(1.8±0.8)歲，兩組年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.21)。

圖1 PMD患兒基因變異涉及的外顯子位置

2.3 臨床特征 24例的父母均否認(rèn)近親結(jié)婚，其中4例(DMD組3例，BMD組1例)有PMD家族史，2例因表哥和親哥確診DMD而就診。22例因其他疾病就診過程中發(fā)現(xiàn)AST、ALT升高，其中13例被診斷為“肝功能不全”行護(hù)肝治療3 d至2年。

23例無肌無力表現(xiàn)，1例(2歲11月)因入院體檢發(fā)現(xiàn)肝功能異常，護(hù)肝治療效果欠佳，同時(shí)發(fā)現(xiàn)下肢近端肌力Ⅳ+、Gower征陽性。4例出現(xiàn)腓腸肌肥大、堅(jiān)硬。嬰兒組11例獨(dú)坐時(shí)間均在7～8月齡；幼兒組13例中5例(DMD組4例，BMD 1例)獨(dú)走時(shí)間>18月齡，8例在12～18月齡。

2.4 血清酶檢測 表1顯示，24例患兒均行AST、ALT、CK、LDH和CK-MB檢測，結(jié)果均明顯升高，且DMD組均高于BMD組，其中ALT、CK、LDH和CK-MB水平兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；嬰兒組和幼兒組上述指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。依據(jù)AST、ALT、CK、LDH和CK-MB在PMD患兒中診斷DMD的價(jià)值行ROC曲線分析，分別計(jì)算各血清酶學(xué)指標(biāo)的約登指數(shù)，以約登指數(shù)最大數(shù)值時(shí)的取值為最佳界值(表2)，以ALT的診斷AUC最大，LDH的特異度最高。

表1 PMD患兒不同年齡和診斷的血清酶學(xué)比較[M(P25，P75)]

表2 血清酶學(xué)指標(biāo)診斷DMD的ROC曲線結(jié)果和最佳界值結(jié)果匯總(95%CI)

3 討論

PMD是由DMD基因突變引起dystrophin蛋白缺陷導(dǎo)致的X連鎖隱性遺傳的神經(jīng)肌肉疾病。dystrophin蛋白連接細(xì)胞骨架肌動(dòng)蛋白與細(xì)胞外基，主要在骨骼肌中表達(dá)。嬰幼兒時(shí)期的DMD和BMD基本處于癥狀前期，此時(shí)骨骼肌尚處于肌肉代償期，兩者臨床癥狀無表現(xiàn)或較輕微，無明顯差別，隨著基因治療技術(shù)逐步實(shí)現(xiàn)，通過分析癥狀前期PMD患兒的各項(xiàng)指標(biāo)，早期區(qū)分DMD和BMD并干預(yù)，具有重要的臨床意義。

本文24例嬰幼兒PMD的臨床表現(xiàn)無明顯差別，早期癥狀隱匿，無明顯肌無力表現(xiàn)，僅1例出現(xiàn)Gower征，可出現(xiàn)如獨(dú)走時(shí)間較晚等運(yùn)動(dòng)里程碑延遲，但均有血清酶升高。嬰幼兒PMD常因其他疾病行肝功能檢測時(shí)發(fā)現(xiàn)ALT、AST升高，故易誤診為肝臟疾病而延長確診時(shí)間。韓春錫等[6]研究顯示患兒就診原因?yàn)镃K、AST、ALT升高占79%；羅智強(qiáng)等[7]研究中納入39例DMD患兒，53.85%因發(fā)現(xiàn)肝酶異常而就診；賀影忠等[2]研究納入96例DMD患兒，23例(24.0%)誤診為肝炎或肝損害、心肌炎、腦癱等；李媛媛等[8]報(bào)道的24例DMD患兒均有保肝治療史。本文13例(48.2%)有“肝功能不全”治療史，最長治療2年，可能與非?？漆t(yī)生的經(jīng)驗(yàn)不足有關(guān)，亦可能是經(jīng)護(hù)肝治療致使血清轉(zhuǎn)氨酶降低而造成“治療有效”的假象。形成該假象的原因?yàn)槌Ｓ玫淖o(hù)肝藥如還原性谷胱甘肽，具有維持膜穩(wěn)定性和抑制炎癥反應(yīng)的作用[9,10]，而PMD的次級(jí)病理機(jī)制是dystrophin蛋白缺陷導(dǎo)致細(xì)胞膜受損及由此繼發(fā)的炎癥反應(yīng)[11]，病因未去除，轉(zhuǎn)氨酶始終無法恢復(fù)至正常水平。嬰幼兒血清轉(zhuǎn)氨酶升高尤其同時(shí)伴有心肌酶譜增高是早期篩查PMD的重要線索，當(dāng)患兒出現(xiàn)病因不明且療效欠佳的“肝炎”、“心肌炎”時(shí)應(yīng)檢測轉(zhuǎn)氨酶、CK、LDH等肌肉相關(guān)酶學(xué)指標(biāo)，若均升高則應(yīng)排查是否為PMD等肌病。

多篇文獻(xiàn)[4,6-8]報(bào)道血清AST、ALT、CK升高是診斷PMD的相關(guān)指標(biāo)，而血清AST、ALT、CK數(shù)值與PMD病情并無相關(guān)性。有文獻(xiàn)報(bào)道[12]，DMD患兒的血清AST、ALT、CK數(shù)值略高于BMD患兒，但兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本文嬰幼兒時(shí)期的BMD和DMD患兒的血清酶學(xué)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，BMD組血清ALT、CK、CK-MB、LDH的數(shù)值均明顯低于DMD組，可能與納入的病例均為嬰幼兒有關(guān)。既往因經(jīng)濟(jì)與醫(yī)療水平所限，患兒常在癥狀出現(xiàn)后就診，DMD于5歲左右出現(xiàn)臨床癥狀，而BMD于11歲左右[4,5]，遠(yuǎn)超過嬰幼兒的年齡范圍。本文中嬰幼兒時(shí)期血清酶指標(biāo)BMD顯著低于DMD組，提示血清酶學(xué)水平越低，BMD的可能性越大，當(dāng)ALT>224.5 U·L-1、CK>11 069 IU·L-1、CK-Mb>204 IU·L-1、LDH>1 349.5 IU·L-1時(shí)為DMD的可能性更高，尤其是LDH>1 349.5 IU·L-1具有高度特異性，

可為臨床早期區(qū)分BMD和DMD提供一定依據(jù)，尤其對于缺乏基因檢測手段及病理活檢的基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)具有重要臨床意義。

DMD基因是目前發(fā)現(xiàn)的人類最大的基因，約2.3 Mbp，由79個(gè)外顯子組成，數(shù)目龐大且結(jié)構(gòu)復(fù)雜，突變率高且突變形式多樣[13]。本文24例PMD患兒中，大片段缺失、大片段重復(fù)、點(diǎn)突變、經(jīng)典剪切位點(diǎn)變異分別占62.5%、8.3%、12.5%、16.7%，與文獻(xiàn)報(bào)道相近[13]。所有類型的突變可發(fā)生在基因的任何位置，本文位于中央?yún)^(qū)的第45～55號(hào)外顯子、位于5’端第5～18號(hào)外顯子2個(gè)基因突變熱點(diǎn)區(qū)域，與既往文獻(xiàn)報(bào)道的突變熱點(diǎn)區(qū)域基本重合[4]。本文病例所有缺失、重復(fù)、剪切位點(diǎn)突變都發(fā)生在熱點(diǎn)區(qū)域，所有的點(diǎn)突變均在熱點(diǎn)區(qū)域之外，是巧合還是另有原因，還需進(jìn)一步探究。Zhao等[3]報(bào)道121例DMD，對64例進(jìn)行驗(yàn)證后證實(shí)43.8%突變來自母親。本文病例變異來源于母親高達(dá)79.2%，其中DMD組77.8%(14/18)，BMD組85.7%(5/6)，兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

綜上所述，血清肌酶水平升高為PMD患兒癥狀前期的主要表現(xiàn)，ALT、CK、CK-MB、LDH對PMD患兒的分組具有指導(dǎo)意義，尤其LDH>1 349.5 IU·L-1對診斷DMD具有高度特異性。